Способ определения сенсибилизации организма вирусом гриппа

(5 й)5 6 01 й ЗЗ/53 ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ИДЕТЕЛ ЬСТ СК А(71) Ленинградский наский институт вакцин и(56) Авторское свидетелЬЬ 919179, кл, А 61 В 1 О/ учно-исследователь ывороток ороповэ. Г.А. Мохо ство ССС00, 1980,(54) СП ЛИЗАЦ ПА (57) Изо и может стояния вирусом Б И ретение относибыть испольэовсенсибилиэацигриппа, Цель и тся к иммунологии ано для оценки сои после вакцинации зобретения - повыИзобретение относ может быть использо тояния сенсибилиэац унитета при гриппо нфекции,Цель изобретения шение точности спосо Способ осуществляится вано ии ной иммуноло для оценки соеточного им экцинации и гии упрощение и повы ют следующим обр ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР СОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СЕИ ОРГАНИЗМА ВИРУСОМ эом,Кровь испытуемого ют во флаконы с гепэри на 1 мл крови), подсч лейкоцитов в 1 мм кро по 0,5 мл в силикониэи в одну иэ которых доб роль) зэбуференного фи твора (рН 7,4), в другие объеме (опыт). Материа 20-минутного выдержив носят в капилляры (3-4 организма собираном (20 ед. гепарина итывают количество ви, кровь разливают рованные пробирки, валяют 0,2 мл (контзиологического рэс - антиген в том же л иэ пробирок после эния при 37 Сперекаппиллярэ нэ каж.Ж 1635140 А 1 шение точности и упрощение способа. Людей вакцинируют вирусом гриппа, проводят забор крови в количестве 1 мл, подсчитывают количество лейкоцитов, инкубируют очищенным вирусом гриппа в течение 20 минут при 37 ОС, Затем кровью заполняют капилляры и повторно инкубируют при 37 фС в течение 30 мин. После инкубирования капилляры промывают, подсчитывают число прилипших к стенкам капилляров клеток и при повышении количества прилипших клеток в пробе с антигеном по сравнению с контролем определяют сенсибилиэацию организма вирусом гриппа. В сравнении с прототипом увеличивается точность способа в 1,8 раза и способ упрощается за счет исключения процедуры выделения лейкоцитов иэ проб крови, Фидую пробу), капилляры ставят в штатив, по-Яследний помещают в горизонтальном положении в термостэт при 37 С на 30 мин, Дляпостановки реакции используют стеклянные градуированные капилляры и штативы,предназначенные для определения скорости оседания эритроцитов по микрометодуПанченкова, При этом капилляры заполняют кровью до метки 50. После инкубирования содержимое капилляров сливают вотдельные пробирки, капилляры дваждыпромывают равным объемом физиологического раствора, сливая его в те же пробирки,и производят подсчет лейкоциты. Затем вычисляют число прилипших лейкоцитов (ПЛТ)к каждому капилляру (в) по формулеП =100,где П -количество п рилилшик леекоцюпов, ;А-исходное количестволейкоцитов в 1 мм;В - количестоо оыцедц. лейкоцитов о 1 мм,При расчете оосгп поправ 1, учиына разведение кровл рост)ором антигена и фцзиологическим раствором при промывке 1 а пилляров, 1(иФрооой м ериал по прилипаелостл лейоцисоо (ПЛ)о а",дой пробе (3 -4 капилляра) обрабаьоаО статистически с вычислением М+ п, Е.ли ПЛ 1 од влиянием антигеа по сравнению с контролем повышается досговерно (Р0,05), то результат реакции си та опг:О 11 тев,но 11 свидетельствуопи 1 ооп11 пцозой сенсибипизации оргаизмаРазность (о ,) 11)лпоно ги пьи коцитоо кежд, кн 1 оп;1 (11,.1 без тигена) и огыом (гроба с ;1 генм) используют в качессве интерапьноо пока. зателя напряженноеи кле)очного иммунитета и сенсибилизаци 1 органзма,Антигены снлр,ссорцца гооня зср, нее. Вирусы гриппа разцожаю 1 а ргзс, вающихся куриных эмбрионах, соораппо оируссодержащую аплантоиснус жидкость очищают и концентрируот методом ультрацентрифугирования орадиенте цло) носи сахарозы, инактивируют формалином, осообождаютот микробной флоры и бактериальных продуктов ультр,филь 1,1,О 1 " и,:каскад миллипоровых чебр 1 1, ,цу 111 у. ют и сохраняют при 14"С Подобч 1 :, логия приготовления вирусюг) .1,., соответствует технологии пьс 111111,:,",инактивированной гриппоэцси,пц 1 нь,При добавлении к оирусной сусензии стабилизатора в виде сыоорото ноо чепп оеческого альбумина (конечнаяь нетра ция 0,2 содержание антигеа выражае) о гемагглютинируощлк единицах (ГАГ) без добавления - в микрограммах белка, определяемого по .пури. Возможно грименение в качестве антигена гриппозной инактивированной вакцины Гринтьл метод изготовления вирусного материала гарантирует его чистоту, стандаргость, стерильность и возмокность дпигепьносо ранения, Степень очистки вирусного материала по белку - не менее 98;4Антигенный материала цо оынеуказанной технологии получают из штаммов вируса гриппа А(РВ)8/34 (Н 1 М 1); А(пиес 59/79 К (Н 1 И 1); А(Чили)1/83/В 2 (Н 1 М 2); А(Ленинград) 385/808 (НЗГ 2), А(слиппины)59/1 (НЗИ 2); Х(НЗМ 2), А(Миссисипи)1/85 (НЗМ 2), а также из вируса болезни Ньюкасл (вакцинный штамм Н) и вируса парагриппа 1 типа Сендай Е,П р и м е р 1. Добровольца (серопогический М 97) вакцинируют вирусом гриппа А(Новошахтинск)3/86/15 (Н 1 М 1) кандидао ноериппозные вакцины, интраназап,о о дозе 0,5 мл (биг)логическая активнос)ь 10 о ЭИД 50/0,2 мл), Производятреоак 1 инацию и 1 же оиоусом и в той же5 1 озе. Гитрн ацигелагпснинов о сыворо пс рцо 1 определяют по реакции тормокон с мо гпютинации с тем же виругом висходом периоде, т.е. через 14 дней послеоакцинации и 14 дней после ресакцинации,10 Состояние сенсибилизации организмавирусом гриппа определяют в исходном периоде до вакц 1 нации) на трегий и четырадцасый дни пог.пе вакцинации и 14 дней1 оспе ренакц 1 ацли. В качесгое антлгена1 1 ГГОП )у 111 г 1 Гнань . с 1 рус Гри- с " ,п 1 1,3 й Г; гсе,й формулой11 1, ь, С 1.111 ГЕЙ :К" 11 С 1 У ШТам 1.о;с.1 жан,с г 1 аггл, тини 1 а - 2560А/0, и 1 Еро, г.ч , низ )слевой ве. 0 ц, 11;,ме," о к: . тг 1 -нт.лкоагулянта ге,; н н,сз,.0 ед.ниц/ л1.;с 1; ь 1 аг .ссс.рксе лейкоцитов1 1, лс.ь;, я ле оцитарные меланжеры 3- у.;ую киспогу для лиэиса, .ро 11 тоо ; амеруореон Кровь разлилц 1 о 0,5 мп н дое силиконэированныесро 1 ркь В одну пробирку добаоляот 0,2 мл..1 ) ен;а 1 1 лопоги еского раствора),, 41оспе цеемешиоания и инкубиро111 11 ) / Г СС)ДОР 1 ИЫ"1 КажДойрр и зспг яют 4 капилляра до меткипп ярстао 1 о 1 птатив, последний1 с)1 еща "р г 1 О)11301 талыом положении В,1" ;,рмост;с на 30 ми прл 37"1; После инкубщии сок мос каждого капилляра спинаог дельцуз пробирку, доажды1 р.),1,о,: о г Физиологическим раствором,абрая погледний до екл 50 и сливая в40 ) у ко пробирку, В пробирке определяют количество лейкоцитов в 1 мм, используя лей 3оцитарные меланжеоы, 3;(-ную уксусную;1 слоту и камеру Горяева, Далее рассчитыглз пр.; црпипших лейкоцитов по45 у.: заной фгрмуле для каждого капиллярао :,р,пс, и Опыте, После статистическойосрОабо) ки материала с оычислением М + годгсоерног.1 ра.личий между пробами:сз антигеца и с антигеном определяют на 50 пряженность клеточного иммунитета и сенсибилизации организма вирусом гриппапутем вычитаьия;Ь ПЛ в контроле Из 7 ь ПЛг; опыте,В исходнол периоде, т,е до вакцина 55 ции доб)авпение антигенов вируса гриппане цриоело к изменениям ПЛ. Напротив ужек третьему дню и особенно к четырнадцатому дню после вакцинации наблюдали эначитспьное повышение ПЛ Повышение ПЛсоставило 21),1, по сравнению с контролем1635140 Формула изобретения Составитель В.ЛитовченкоТехред М.Моргентал Корректор Л.Пилипенко Редактор А.Ревин Заказ 754 Тираж 412 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул Гагарина, 101 После ревакцинэции ПЛ также несколько повысилось до 30 в сравнении с контролем. Титр антигемагглютининов увеличился в 4 раза через 2 недели после вакцинации (положительная сероконверсия) и не изме нился после ревакцинации.Результаты опыта подтверждают, что после иммунизации живой гриппозной вакциной развивается состояние сенсибилизации организма к вирусу гриппа. апре деляемое предлагаемым способом, основанным на реакции повышения прилипаемости лейкоцитов.В сравнении с прототипом увеличивается точность определения сенсибилизации 15 организма вирусом гриппа при использовании предлагаемого способа.Так, коэффициент вариации по прототипу почти в 2 раза превышает аналогичный по предлагаемому способу (47 против 20 25 ф), т.е, точность увеличиватся в 1,8 раза. По сравнению с прототипом наблюдается и упрощение способа эа счет исключения и ро";.цедуры выделения лейкоцитов иэ исследуемой крови. Способ определения сенсибилизации организма вирусом гриппа. включающий иммунизацию, забор крови в две пробы, подсчет количества лейкоцитов, инкубацию проб с антигеном с последующим учетом реакции в капиллярах, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности и упрощения способа эа счет исключения этапа выделения лейкоцитов, в качестве анти- гена используют очищенный вирус гриппа с последующим подсчетом числа прилипших к стенкам капилляра лейкоцитов и при повышении числа прилипших лейкоцитов в пробе с антигеном по сравнению с пробой беэ антигена определяют наличие сенсибилиэации организма к вирусу гриппа.