Способ определения активности дегидрогеназ в лимфоцитах

(51) 5 С 01 Н 33/68 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР Я Н А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(57) Способ опдегидрогеназ вк области медитологии. Цельюповышение точи реде лимф и ны изо ости Изобретение отно а именно к гематоло но для цитохимическ активности дегидрог Цель изобретения ности способа за с выявления активност одновременном ускор исключения. Фиксации перед инкубацией за инкубация проводитс жащей альбумин, кот удержанию клеток на и сохранению их фор ванию жирных кислот гидрогеназы. Способ осуществя образом.по бо дегидр нии спо мазков счет то в сред рый спо предмет мы, а тагеназоба путкровио, что и содеробствует ом стекл кже связыующих деинг ся следующи(21) 43911 (22) 09.03 (46) 30.03 (71) Свердт тельский и зиотерапии (72) С.Е.И (53) 612.0 (56) Архив эмбриологии АНИЕ ИЗОБ щенко и В.С.Войтенок5(088.8)анатомии, гистологии1969, В 5, с. 85"9 ЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЛИМФОЦИТАХеделения активностиоцитах относитсяа именно к гемабретения являетсяспособа за счет более полного выявления активностирегидрогеназ. Активность дегидрогеназ определяется цитохимическим методом с использованием инкубационнойсреды, содержащей и-нитротетразолиевьв"фиолетовый, субстрат окисления, фосфатный буфер, этилендиаминтетраацетати сывороточный альбумин,конечная кондентрация альбумина 5 Ж. Использование сывороточного альбумина как компонента инкубационной среды способствует удержанию клеток на предметномстекле и сохранению их формы без пварительной фиксации мазка, а такжсвязывает жирные кислоты крови, ингибирующие дегидрогеназы. Одновременно обеспечивается ускорение способа.1 табл. Свежеприготовленные и высушенные при комнатной температуре в течение 30 мин мазки крови инкубируют во влажной камере при 37 С в течение 60 мин со средой следующего состава; и-нитротетразолиевый фиолетовый 0,25 мг/мп, субстрат соответствующей дегидрогена-" зы О,1 моль/л с коферментом (1 мг/мл), если он необходим для окисления субстрата, фосфатный буфер 0,07 моль/л (рК 7,2), этилендиаминтетраацетат 0,5 ммоль/л, сывороточный альбумин 5 мг/мп. После инкубации мазок крови сушат при комнатной температуре, фиксируют в парах формалина 30 мин, ополаскивают дистиллированной водой и докрашивают краской Романовского (1 капля на 2 мп дистиллированной во 3 1553ды) в течение 10-15 мин. Иикроскопи 1рование проводят с масляной иммерсионной средой. Подсчитывают в клеткахкрови образовавшиеся гоанулы Фориазана, по количеству когорых судят обактивности дегидрогеназ,Преимущества предлагаемого способазаключаются в расширении диапазонавыявления активности фермента (что1.9позволяет отметить более тонкие градации метаболического состояния клеток крови в условиях нормы и патологии), существенном уменьшении доликлеток с нулевой активностью фермен 15та и сокращении общего времени приготовления препарата до 3-3,5 ч.При определении активности сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов периферической крови предложенным спосооомвстречаются клетки, содержащие от 1до бО и более гранул, формазана, при,чем активность Ферментов выявляется в97-992 лимфоцитов, в отличие от известного способа, по которому содержание лимфоцитов с нулевой активностью значительно (около чОЕ).П р и м е р . Определение активности сукцинатдегидрогеназы.Испытания проведены на 20 белыхбеспородных крысах массой 200-230 г.Кровь получали путем пункции хвостовой вены. Готовили по 4 мазка кровиот каждой крысы, один из которых обрабатывали предложенным способом,35второй - без субстрата окисления всреде инкубации (контроль), третий -по способу-прототипу, четвертый - попрототипу, но без субстрата окисления в среде инкубации (контроль).Приготовление препарата предложенным способом производилось в следующейпоследовательности.Свежеприготовленные мазки крови сушили при комнатной температуре 30 мин,45Далее предметные стекла с мазками помещали во влажную камеру, поверх мазка наливали 0,8 мп инкубационной среды следующего состава: и-нитротетразолиевый фиолетовый 0 25 мг/мл сукциУ 950нат натрия 0,1 моль/л, Фосфатный буФер 0,07 моль/л (рН 7,2), этилендиаминтетраацетат 0,5 ммоль/л. Контрольноеисследование проводили с инкубационной средой того же состава, но безсукцината. Инкубацию проводили в теромостате при 37 С бО мин. Затем мазки извлекали из термостата, высу 1 пивалипри комнатной температуре под струей воздуха от вентилятора, проводили фиксацию мазков в парах. Формалина 30 мин,ополаскивали дистиллированной водой,сушили и докрашивали разведеннойкраской Романовского (1 капля на2 ил дистиллированной воды) 10 мин.Приготовление препарата по методике прототипа проводили следующим образом,Свежеприготовленные мазки кровисушили при комнатной температуре 2 ч.Далее мазки фиксировали в холодном603-ном ацетоне, насыщенном этилендиаминтетраацетатом, в течение 30 с,промывали дистиллированной водой,высушивали на воздухе и инкубировали во влажной камере при 37 ОС бО минсо средой следующего состава: и-нитротетразолиевый Фиолетовый 0,25 мгlмп,сукцинат натрия О, 1 моль/л, фосфатныйбуфер 0,07 моль/л (рН 7,2), этилендиаминтетраацетат 0,5 моль/л. Послеинкубации мазок промывали дистиллированной водой, проводили дополнительную Фиксацию в парах формалина 30 мин,промывали дистиллированной водой,сушили и докрашивали 0,57.-ным раствором метиленового зеленого на ацетатном буфере (рН 5,0) в течение 10.мин.Иикроскопировали высушенные мазкинод масляной иммерсией при увеличении12 х 1,25 х 100, Подсчитывали количествообразовавшихся гранул формазана в50 лимфоцитах.Результаты испытаний показали, чтов обеих контрольных пробах (без субстрата окисления) гранулы формазана вклетках, как правило, не образовывались, редко - одна-две.Статическая обработка результатовпроведена при помощи парного критерияВилкоксона.Результаты испытаний представленыв таблице.Ф о р м у л а и з обретенияСпособ определения активности дегидрогеназ в лимфоцитах путем приготовления мазков крови, инкубации их в среде, содержащей буферный раствор, субстрат окисления, этилендиаминтетраацетат и и-нитротетразолиевый фиолетовый с послЕдующим высушиванием мазков и подсчетом гранул формазана в лимфоцитах под микроскопом, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что с це5 1553903 6лью повышения точности способа эа счет нии способа, в среду инкубации допол;более полного выявления активности нительно вводят сывороточный альбумиЪ;легидрогеназ при одновременном ускоре- в концентрации 5 мг/мп. рототип Предлагаемый спосо Характеристи Среднее количество гранул формаэа"на на 1 лимфоцитСодержание лиитто".цнтов с нулевойактивностью фермента, ХПродолжительностьприготовления препарата, ч 0,001 2,5 01 38 3 Составитель Н.ГуляеваРедактор Л.йчолинская Техред Л.Сердюкова Корректор Н.Ревская Заказ 454 краж 523 Под ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям113035, Москва, Ж, Раушская н писное открытиям при ГКНТ СССРю д 45 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,