Способ получения олигодезоксирибонуклеотидов

(51)5 С 0721 04 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ в абсолют- блокировалеотид ных г епировани токситрийкозатимидипрото чног Сном коли- сител ый они ом ле ель створа ,025 м( итил оксит миди ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР 1(56) Грязнов С.1., Чернов И.П., Потапов В.К. и др. Автоматический синтез 20-47-звенных полидезоксирибонуклеотидов АосФитямдным методом ня синтезаторе "Виктория - 4,М"- Биорганическая химия, 1986, т.12, 1 12,с.1604.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕЦИЯ ОЛИГОДГЗОКСИРИБОНУКЛГОТИДОВ(57) Изобретение касается нуклеоИзобретение относится к биотехнологии и генной инженерии, в частности к способу получения Арагментов (1 ПК заданной первичной структуры - олигодезоксирибонуклеотидов, и может быть использовано для синтеза зрягментов генов, олигонуклеотидных праймеров, зондов и других генетических структур.Цель изобретения - ускорение, упрощение и удешевление процесса синтеза олигонуклеотидов.Цель достигается осуществлением постадийной межнуклеотидной конденсации 3 -нуклеотидного компонента, в качестве. которого используют 5 -0- -диме то к стритл-яил-О-ме тил(гдроФсбт нуклеозида с 5 - нуклео - идм компонентом в присутствии 801541215 А 1 2тидов, в частности получения олигодез. оксирибонуклеотидов, применяемых для синтеза генетических структур, Синтез ведут конденсацией 5-нуклеозидного компонента, находящегося на полимерном носителе, с 5-0-диметокситритил-яцил-О-метлгдроосфтом. нуклеозида в присутствп раствора иода в абсолютном пиридине с последующим блокированием не вступивших в конденсацию 5-гидроксильных групп нуклеозидного компонента и удалением 5-0-диметокситритильной группы.Эт условия позволяют сократить продолжительность процесса в 2,5-3 разя и объем растворителей в 3-6 раз,что в целом упрощает и удешевляет процесс1 табл. окисляющего агента - йоданом пиридине с последующинием не вступивших в межнконденсацию 5 -гицроксильнуклеозидного компонента-тильной защиты.П р и м е р 1, Синтезловой кислоты (Тр)( Т.В реакционную колонкутипа помещают 20 мг силохс иммобилизовянным тимидичестве 25 мкм/г. Полимерпромывают абсолютным яцет20 с (0,6 мл), а затем поно добавляют 0,025 мл 0,1иода еасолю ГомирдинО, 1 11 раствора 5 -О-димет1541215 1 Время, с Реагент Операция ВОС 00 ВО Ор-ОИ -"1Н Цежнуклеотиднаяконденсация 100 и 0,05 11 1 в пиридине СН СИ Промывка 111 Лс,О в 11 е 1 т: ЕсзИ: СПЛАСИ 1: 4,5: 30 (ч/тр) Кепирование 10 20 40 30 Промывка СП зС 11Детритилирование 0,1 1 СРзСООН в СН,С 1 Промывка СН смесь выдерживают 40 с. Процесс повторяют, выдерживая реакционную смесьбО с,Затем полимерный носитель промывают ацетонитрилом 10 с (0,3 мл)и обрабатывают кепирующей смесью состава 111 ЛсО в 11 е 1 тп : Гс.И : СНзСИ1:4,5:30 ч/ст (Ие 1 тп - метилимидазол)30 с, промывают абсолютным ацетонитрилом 20 с (О,б мл) и детритилируют 1040 с (1 мл) 0,1 11 раствором трифторуксусной кислоты в хлористом метилене. После отмывки абсолютным ацетонитрилом 30 с (1 мл) полимерный носитель готов для проведения следующихсинтетических циклов, которые аналогичным образом осуществляют еще18 раз,По окончании синтеза полимерный носитель извлекают из реактора и обрабатывают 0,2 мл смеси тиофенол /триэтиламин/диоксан/1/2 ч/т 30 мин,При синтезе гетерогенных последовательностей в качестве нуклеотидных компонентов на соответствующих стадиях используют 3 -0-метилгидрофосфи/ 45 ты 5 -0-диметокситритил-М-бензоиладенозина, 5-0-диметокситритил-бензоилцитозина, 5 -О-диметокситритил -Б-изобутирил гуанозина и 5 -О-диметокситритил тимидина, По окончании 50 синтеза полимерный носитель обрабатывают как описано в примере 1 за исключением аммонолиза, который проводят 16 ч. Аммонолизат отделяют от полимерного носителя, концентрируют в 55 вакууме, Целевой продукт выделяют методом электрофореза в полиакриламидном Геле, Средний выход продукта затем промывают диоксаном (4 х 0,5 мл), заливают 0,5 мл 28 Х-ного водного аммиака и выдерживают 30 мин прио50 С, Полимерный носитель отделяют от раствора, промывают водой (3 х х 0,1 мл), фильтраты объединяют, концентрируют в вакуумеРеакционную смесь анализируют и выделяют целевой продукт методом обращенной фазовой ВЗЖХ. Средний выход продукта межнуклеотидной конденсации на стадию в расчете на удаляемую (ИеО)Тг-группу 987, а на выделенный продукт 907,П р и м е р 2.Получение гептадекануклеотида 5 ОТЛЛААСОАСССССАСТ.Синтез олигонуклеотида осуществляют аналогично синтезу эйкозатимидиловой кислоты в соответствии с картой-схемой, представленной в таблице. межнуклеотидной конденсации составляет 897. на стадию в расчете на целевой продукт,Таким образом, предлагаемый способ поэволяет сократить время каждого синтетического цикла в 2,5-3 раза и в 3-б раз сократить объем используемых растворителей. Формула изобретенияСпособ получения олигодезоксирибонуклеотидов, включающий конденсацию 5 -нуклеозидного компонента, находящегося на полимерном носителе, с активированным 3 -нуклеотидным компонентом, блокирование не вступивших в межнуклеотицную конденсацию 5 -гидроСоставитель Г.КонноваТехред М,дндык Корректор М.1 Дароши Редактор Н. Гунько Заказ 262 Тираж 299 ПоцписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г,ужгород, ул. Гагарина, 101 5 15412 ксильных групп нуклеоЗидных компонентов и последующее удаление 5 -О-диметвкситритильной защитной группы, о тл и ч а ю щ и й с я тем что с цеЭ 95 лью ускорения, упрощения и удешевления процесса получения целевого продукта,в качестве активированного 3 --нуклеотидного компонента используют 5 -О-диметокситритил-И-ацил-О-ме тилгидрофосфит нуклеозида, осуществляя конденсацию в присутствии раствора иода в абсолютном пиридине, а блокирование проводят непосредственно посЛе стадии конденсации,