Способ определения антиоксидантной активности химических соединений

(9) (И 3/4 Со.(МИ ИСАНИ РЕТЕНИЯ нтную акт го определяют акт оксидмиче ких соед овней хе ость иссле нении, а п вьппении у ейтрофило в присутстй относител люминесценци вии исследуе но исходного ность. 1 таб ых сое прооен ти ант ппение точ ль иэ ретения ктивнос способа при одего Функцио ности и сел новременном расширении ожкостей.уществляют альных в Способ следующим о зом ГОСУДАРСТВЕННЫИ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМРРИ ГННТ СССР ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ(57) Изобретение относится к экспериментальной и клинической медицине, вчастности медицинской биофизике, клинической фармакологии, биохимии, пато Физиологии, и может быть использованодля определения про- и антиоксидантной активности химических соединений,Изобретение относится к экспериментальной и клинической медицине, вчастности к медицинской биофизике,клинической фармакологии, биохимии,патофизиологии, онкологии и иммунологии, и может быть использовано длямедикобиологических исследований сцелью определения про- и антиоксиданной активности различных химическихсоединений,С целью повышения точности при одновременном расщирении функциональныхвозможностей способа за счет одновременного определения прооксидакткойактивности определяют уровни спонтанной и индуцированной латексом диаметром 1,7 мкм хемилюминесценции нейтроФилов в присутствии исследуемых соединекий и без них (сходный уровень), ипри снижении уровней хемилюминесценции нейтрофилов в присутствии химических соединений относительно исходСиликонизированные стеклянные Флакокы с буфером, состоящим из физиологических концентраций БаС 1, КС 1, КНРО, БаНРО, НЕРЕЯ, .-глутамика и глюкозы и применяемым для выделения клеток, добавляют 1 мл раствора, содержащего 50 мкг люминола, 0,1 мл нейтрофилов (10+-10 /мл), исследуемые химические соединения, Регистрацию хемилюминесценции (ХМ) осуществляют сразу после добавления препаратов в течение 1-4 мин на жидкостном сциктилляциокном счетчике ЬЯ(Весктап), Для индукции ХЛ добавляют в среду инкубации 0,01 мл латекса (диаметр частиц - 1,7 мкм) и вновьрегистрируют ХЛ нейтрофилов. При этом вещество, снижающее спонтанную ХЛ от/ носят к антиоксидантам, а повышающее - к прооксидантам. В случае снижения ХЛ активированных нейтрофилов при неизменной или увеличенной ХЛ интактных нейтрофилов устанавливают, что антиоксидантная активность связана с подавлением фагоцитоза, 10П р и м е р 1. Гетаринизированную венозную кровь отстаивали в течение ,30 мин при 37 С, плазму наслаивали на двойной градиент фиколлверографи,на (с 1,077, с 1 = 1,093). После 15 30 мин центрифугирования при,1500 об/ ,/мин на границе двух градиентов образовалось кольцо нейтрофилов, которые удаляли, отмывали дважды в буфере, ,содержащем физиологические концентра ции ЮаС 1, КС 1, КНЕР 04 Ва НРО,. НЕРЕБ, Ь-глутамин и глюкозу (рН 7,4); центрифугировали с ускорением 1500 я в течение 10 мин. Затем клетки ресус,пендировали, доводили до концентрации 25 10 /мл и испольэовали для определения ХЛ. Жизнеспособность нейтрофилов оценивали по эксклюзии трипанового 1 синего и во всех экспериментах она составляла 99-1003.30В качестве прооксидантов использовали известные соединения; ГеБО(10 мкМ НО(0,01 мл 37 раствора),мМ НАДФ Н В качестве антиоксидантов использовали глутатион (1 мМ) и среднемолекулярные пептиды (СМП) крови в количест. ве 20-40 мкг/мл. Кроме того, исследовали химические соединения с йеизвестной ранее оксидантной активностью: акридиновый оранжевый (0,002 мг/мл),40 солкосерил (200 мкг/мл) и спиртовый экстракт плазмы крови (200 мкг/мл), Для выявления оптимальных режимов индуцированной ХЛ использованы раэличньн. активаторы - полистирольные моно дисперсные латексы ф 0,5; 1,0; 1,7;2,11," 2,65 мкм, латекс 6 1,7 мкм с сорбированным 1 яС., ревматоидный диаг-ностикум (латекс с сорбированным - глобулином и опсонизированный зимозан (Бз.рпа) . ХЛ измеряли в имп/мин. Интенсивность вспышки оценивали как отношение к ХЛ интактных нейтрофилов в услов 55 ных единицах, общую сумму вспышки оце- нивали за все время исследования, среднее значение интенсивности вспышки оценивали в условных единицах,Полученные результаты свидетельствуют о том, что полистирольный латекс (ф 1,7 мкм) является наиболее оптимальным стимулятором ХЛ ыейтрофилов, так как максимальная вспышка ХЛ отмечается в 1-2 мин регистрации и амплитуда вспышки на него является наибольшей по сравнению с другими активаторами.Ионы Ге + существенно стимулируют2+спонтанную и индуцированную ХЛ в 5,7 и 1,6 раз соответственно: НАДФН в 1,35 и 1,6 раз; Н Ое в 13,6 раэ стимулирует спонтанную ХЛ, несколько снижая индуцированную ХЛ; глутатион снижает спонтанную и индуцированную ХЛ в 3 раза; акридиновый оранжевый в 4 и 6 раэ соответственно; СПМ крови в 6 и 7 раз; солкосерил в 1,5 и 3 раза; спиртовый экстракт крови в 3 и 80 раз.П р и м е р 2, В таблице приведены данные о влиянии различных химических соединений на спонтанную и индуцированную латексом ХЛ нейтрофилов, выделенных из другой пробы крови,Оценивали светосумму свечения как средний результат интенсивности ХЛ за период наблюдения (имп/мин).Про- или антиоксидантная активность химических соединений оценива/лась в процентах как отношение свето" суммы свечения нейтрофилов в присутствии исследуемых химических соединений к светосумме свечения интактных или активированных латексом нейтрофилов.Предложенное техническое решение расширяет функциональные возможности способа путем определения не только антиоксидантной, но и прооксидантной активности (действие ионов Ге , Н 0, СМП крови от оборокенных животных), Расширение функциональных возможностей способа и повышение его селективности также демонстрируется возможностью дифференцированного подходак изучению влияния химических соединений на спонтанную ХЛ интактных нейтрофилов и ХЛ, индуцированную латексом, т.е, сопряженную с фагоцитозом.Возможность выявлять химические соединения, антиоксидантная активность которых связана с подавлением фагоцитоза (путем исследования уровней спонтанной и индуцированной латексом ХЛ нейтрофилов человека, в случае снижения ХЛ активированных нейтрофилов при неизменной или увеличенной ХЛ интактных нейтрофилов) яв1532869 6 рофилов устанавливают, что антиоксиь дантная активность химических соединений связана с подавлением фагоци тоэа. Исследуемые химические соединения Отношение Отношение формула изобретения интенсивности ХЛакинтенсивности ХЛнейтрофилов в присутствиихимическихсоединенийк ХЛ интивированных латексом,нейтрофилов в присутствии химитактныхнейтрофилов, Х ческих соединений к ХЛ активированныхлатексомнейтрофилов, Е 96 39 32,8 51,4 28,3 10,3 1,531,5т Составитель И.ГуляеваТехред Л. Олийнык Корректор Э.Лончакова Редактор О.Спесивых Заказ 8094/Ы Тираж 789 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета о изобретениям и открытиям при ГЕНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 ляется существенным преимуществомданного способа. Это дает возможностотбирать лекарственные средства спротивовоспалительным действием, вчастности препараты, влияющие на фа-гоцитоэ,1. Способ определения антиоксидантной активности химических соединений путем введения исследуемого химического соединения в биологический объект, индукции свободнорадикаль" 15 ного окисления и оценки антиоксндантной активности по разнице интенсивности хемилюмииесценции в присутствии и отсутствие исследуемого соединения, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с 20 целью повышения точности при одновременном расширении функциональных возможностей способа эа счет одновременного определения прооксидантной ак-, тивности, в качестве биологического 25 объекта используют нейтрофилы человека, измеряют хемилюминесценцию нейтрофилов и при снижении хемилюминесценции в присутствии исследуемого соединения определяют антиоксидантную активность, при повышении - прооксидантную активность.2. Способ по п,1, о т л и ч а ющ .и й с я тем, что, с целью повышения селективности способа, используют нейтрофилы человека, активированные35 латексом, и в случае снижения хемилюминесценции активированных нейтрофилов на фоне неизменной или увеличенной хемилюминесценции иныктных нейт" Ре 80(10 мкИ) 330 О,ЗЖ НцОр(0,01 мп) 805 Солкосерил (100 мкг) 66,7 СМП иэ крови животных с термической травмой(10 мкг) 155 СМП иэ крови здоровых животных