Способ получения токсинопродуцирующих субкультур холерных вибрионов

,152 СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН 091 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ТЕЛЬСТВО ВТОРСНОМУ 4) нИзобретение от ской микробиологии активизации токсин культур холерных в Цель изобретениносится к меи касаетсяопродуцирующиибрионов.я - упрощени ицин- пособ х е споГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ ГННТ СССР(53) 576.8.093.33 (088.8) ,(56 ) В 1 асЬшапп П, ее,а 1 . ИЪгдо сЬо 1 егае ргойасгхоп о 1 йохо Ъу а попраТЬояепдс яггап. - 1.1 пГ.01 я, 1970, 122, И б, р.540-543.Лобанов В.В., Пасюкова Н.И. Выде ление субкультур, образующих холерный токсин 1 п чего из кишечника и фицированных кроликов-сосунков. Рос тов-на-Дону, 1985 (рукопись депони рована, 9 3890-85, Деп) . соба.Способ осуществляется следующим образом.Культуру исследуемого штамма хо"О лерного вибриона выращивают при 37 С в течение 4-5 ч в жидкой среде, состоящей из ЗХ-ной пептонной воды, 0,57 хлористого натрия и 0,05-0,2 Х инозина (рН 7,8-8,0). Для получения изолированных колоний выращенную бульонную культуру высевают на 2%-ную агаровую 1)4 С 12 М 1/20, (С 12 К 1/20, с 1 Т е 1 у СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТОКСИНОПРОДУЩИХ СУБКУЛЬТУР ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ(57) Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности кспособам получения культур холерныхвибрионов, продуцирующих холерныйтоксин. Цель изобретения - упрощение способа. Культуру исследуемогоштамма холерного вибриона выращиваютв течение 4-5 ч в жидкой щелочнойсреде с 0,05-0,2% инозина (рН 7,88,0). Для получения изолированныхколоний выращенную бульонную культуру высевают на 2 Е-ную агаровую средутого же состава и инкубируют 1820 ч при 37 С. Токсигенные свойствахолерных вибрионов, составляющих отдельную колонию, определяют известнымспособом, 1 табл,среду того же состава и инкубируют 18-20 ч при 37 С. Токсигенные свойства холерных вибрионов, составляющих отдельную колонию, определяют известным способом.П р и м е р 1. Культуру Ч 1 Ъгю сЬо 1 егае 569 В в течение 4 ч выращиваоют при 37 С в 4 мл среды следующего состава, г/100 мл; пелтон (мясной для бектериологических целей) 3; хлористый натрий 0,5; иноэин 0,05; вода дистиллированная остальное, рН 8,0.После окончания выращивания бульонную культуру пересевают на плотную (2 Х-ную агаровую) среду такого же состава с целью получения иэолирован 1521770ных колоний и инкубируют при 37" С18-20 ч.Субкультуры, полученные из изолированных колоний исследуют на спо 95собность продуцировать холерный ток"син, для чего часть материала каждойиз отобранных колоний засевают на З ную пептонную воду с 0,57. ВаС 1 (рН7,8-8,0), разлитую по 2 мл в 100-миллилитровые стерильные флаконы с ватно-марлевой пробкой. Выращивание проводят при 37 С в течение 20 ч. Послеокончания срока выращивания культурыобеээараживают мертиолатом (1;5000),центрифугируют при 6000 обмин 30 мини надосадочную жидкость исследуютна наличие Фактора кожной проницае"мости в цельных и разведенных препа,ратах на модели кролика (внутрикожная проба Крейга).Из 20 субкультур штамма 569 В все20 продуцируют в среду культивирования Фактор кожной проницаемости,оказывающий действие на кожу кролика при 5разведении надосадочной жидкости 1;20,При разведении 1:40 такую активностьпроявляют б субкультур, 1:80 - 13,1: 160 - 1.П р и м е р 2. Проводят аналогично примеру 1, но в состав средыЗОвводят 0,17 .инозина. Используют 2штамма - Ч.сЬо 1 егае 569 В и 7е 1 СогР 5879В результате исследования 20 субкультур штамма 569 В все культуры про дуцируют в среду культивирования фактор кожной проницаемости, оказываю"щий действие на кожу кролика приразведении надосадочной жидкости 1;;20. При разведении 1:40 такую активность проявляют 8 субкультур,1:80-9, 1:160-3Из 125 субкультур штамма Р 5879Фактор кожной проницаемости обнаружен у 17 при введении цельных и раз 45веденных 1;2 препаратов надосадочнойжидкости, В более высоких разведенияхпри постановке кожной пробы он непроявлялся,П р и м е р 3, Проводят аналогично примеру 1, В среду вводят 0,27.инозина. В результате среди 20 субкультур штамма 569 В все 20 продуцируют Фактор кожной проницаемости втитре 1;20, 18 - 1:40, 2 - 1 ф 80 и не 55продуцируют токсин при разведениинадосадочной жидкости бульонныхкультур 1:160, Результат влияния пассажей через кишечник кролика-сосунка и среду с инозином на количество выделяемых клоновых субкультур штамма Ч.с 1 то 1 егае 569 В "Пакистан" приведены в таблице. Субкультуры Изу- ченТоксинооб 7. токсиноо бразующихиз числа ные; 10) изученных 20 Исходные 100 20Пассированныечерез кишечник 50 36 72среду синозином 25 17 68 Таким образом, предлагаемый способзначительно проще способа-прототипапри сохранении его эффективности,так как не требует использования лабораторных животных, создания специальных условий для их вскрытия.Способ позволяет также в дальнейшем получить количественную характеристику культур по изучаемому признаку. При его использовании можно выделить гиперпродуценты среди субкультур производственных штаммов холерного вибриона, создать коллекциюштаммов холерных и эльтор вибрионовс различной способностью продуцировать холерный токсин, что необходимодля проведения генетических исследований,Способ дает возможность с помощьюизучения токсинпродукции клоновыхкультур провести анализ популяции вдовольно большом объеме (до 100 одно"моментно) с сохранением этого генетического материала для дальнейшегополучения необходимых характеристик. Формула из о бр етения Способ получения токсинопродуцирующих субкчтьтур холерных вибрионов путем активации исходной культуры с последующим пересевом на плотную щелочную питательную среду и определения токсинообразующей активности изолированных колоний, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что, с целью упроще 1Составитель А.ЗавадскаяТехред Л.Олийнык Корректор Т.Малец Редактор Н.Киштулинец Заказ 6892/24 Тираж 501 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 5 1521770 6ния способа, активацию осуществляют ние на плотной питательной среде вев жидкой питательной среде в присут-. дут в присутствии иноэина в той же ствии 0,05-0,2 Ж иноэина и выращива- концентрации.