Способ криоконсервации эмбрионов кур

55 1 134Изобретение относится к криобиологии, а именно к области низкотемпературного консервирования биологических объектов, в том числе с последующим их культивированием в искусственных условиях, и может бытьиспользовано в ветеринарии, медицинеи биологической промышленностии.Цель изобретения - повышение выхода и сохранности клеток, полученных из криоконсервированных птичьихэмбрионов и упрощение состава криозащитной среды,П р и м е р 1. 10-дневные куриныеэибрионы из заведомо благополучногопо инфекционным и инвазионным заболеваниям птицехозяйства просматривают на предмет определения жизнеспособности в овоскопеВ работе используют эмбрионы, проявляющие в овоскопеподвижность. Затем скорлупную оболочку дважды обрабатывают 57-нойнастойкой иода и со стороны путем спомощью обезвреженной инъекционнойиглы делают прокол, направляя еесрезанный конец с внутренней стороныподскорлупной оболочки до среднегоуровня длины яйца и отсасывают10 мл окружающей эмбрион жидкости,Эмбриональную жидкость удаляют и вполость вводят 10 мл дииетилсульфоксида (ДМСО), то есть 207 по отношению к объему содержимого яйца с эмбрионом (50 мл). ДМСО предварительноперегоняют в вакууме, а перед введелием нагревают до 31 С. После извлечения иглы отверстие в скорлупной оболочке заклеивают расплавленным на спиртовке стеклографом и куриные эмбрионы помещают на 35 минпри 37 С.По истечении периода эквилибрациис криозащитной средой эмбрионы проверяют в сзоскопе на предмет их жизнеспособности (в работу берут толькоподвижные эмбрионы). После нарушенияцелостности скорлупной оболочки эмбрион с помощью пинцета извлекают изяйца и помещают в стерильной полиэтиленовый контейнер (полиэтиленовыеконтейнеры после тщательной промывкив 96 -ном спирте-ректификате подвергают ультрафиолетовому облучению).Контейнеры с эмбрионами перемещают в металлические пеналы и загружают в камеру аппарата для программного замораживания биологических объекотов, где охлаждают от 10 до - 80 Сосо скоростью 0,3-0,5 с в минуту с 10 15 20 25 30 35 40 45 50 последующим погружением биоматериала на хранение в жидкий азот. После хранения в жидком азоте контейнеры с эмбрионами перемещают для дефростаоции в водяную баню при 40 С. Затем в условиях стерильного бокса эмбрионы извлекают из контейнеров и помещают во флаконы с раствором Хэнкса (рН 7,2-7,4), После 2-кратного отмывания в растворе Хэнкса от туловища эмбриона отрезают голову, удаляют внутренности и измельчают ножницами до фрагментов величиной в 2-3 мм. Фрагменты ткани подвергают дезагрегации трипсином по общепринятой методике. В полученной взвеси определяют процент жизнеспособных клеток и далее их культивируют на питательной среде 199 с добавлением равного количества 0,57.-ного раствора гидролизата лактальбумина в растворе Хэнкса и 107-ной сыворотки крови крупного рогатого скота. Результат: уровень жизнеспособных клеток составил 877., а выход живых клеток от одного эмбриона достиг 61 млн, По истечении 3 сут культивирования образовался монослой клеток.П р и и е р 2. Способ осуществляют аналогично примеру 1 за исключением лишь того, что из эмбриона удаляют 2,5 мл омыващей его жидкости и вводят столько же ДМСО (57 по отношению к объему содержимого яйца). Результат: уровень жизнеспособных клеток составил 157., а выход живых клеток от одного эмбриона достиг 5 млн, По истечении 6 сут культивирования отмечалось прикрепление клеток, однако формирования монослоя не произошлоП р и м е р 3Способ осуществляют аналогично примеру 1 за исключением лишь того, что из эмбриона удаляют 5 мл омывающей его жидкости и вводят столько же ДАССО (107. по отношению к объему содержимого яйца).Результат: уровень жизнеспособных клеток составил 507, а выход живых клеток от одного эмбриона достиг 35 35 млн. По истечении 6 сут культивирования монослой образовался на 207 поверхности культурального сосуда. формула изобретенияСпособ криоконсервации эмбрионов кур путем введения криопротектора в ткань эмбриона, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышенияСоставитель Е. КолмаковаТехред А.Кравчук Корректор М. Шароши Редактор В, Данко Заказ 4819/47 Тираж 776ВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Подписное Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 выхода жизнеспособных клеток откаждого эмбриона, из полости яйцаудаляют эмбриональную жидкость в 13433574количестве 15-307. от объема внутреннего содержимого яйца и внодят такое же количество криопротектора.