Способ определения дефектности лимфоцитов

СОЮЗ СО 8 ЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК К 39/00,6 01 И 33/49 04 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕН АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ вательсерства Буйка в тов ушрЬосу 1 ев рЬосуйев 1. сп хр;шед,в. 2, С щийс вором т дут в т тличаюаботку растбутила вен 37 С,п.1,что о т НИЯ ДЕопред ретичн ечение рекиси мин пр ОСУДАРСТ 8 ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИИ(56) Зопйа 1 М.е а 1 Яцгйасешаг 1 егв оп Ьцшап Т апй В 11.А. 1 агее рорц 1 а 1 оп оЕ 1 уш.Йотаап 8 попдшпюпе товесеев ювЬерр ей Ь 1 оой се 11. - Л.1972136, 207.(54) (57 ) 1. СПОСОБ ОПРЕДЕФЕКТНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ пут ления количества Т- и В-лимфоцитовв периферической крови с помощью ракций Е- и ЕАС-розеткообразования,о т л и ч а ю ш и й с я тем, что,с целью повышения точности способа,лимфоциты делят на две пробы, водну из которых добавляют 1-2 мкмолраствора третичной перекиси бутила,после определения количества лимфоцитов в обеих пробах их сравниваюти при снижении количества лимфоциболее чем на 5 Х в обработанной пробе определяют дефектность лимфоци 1260006Изобретение относится к медицине,в частности иммунологии, а именнок методам диагностики иммунологической реактивности организма.Целью изобретения является повышение точности способа определениядефектности лимфоцитов крови.Способ осуществляют следующимобразом,Иэ вены больного набирают 3,5150 мл крови, которую помещают впробирку с 0,1 мл гепарина. Вцентрифужную пробирку наливают 2 млФиколл-верографиновой смеси, затемосторожно в нее наслаивают разведенную изотоническим раствором хлориданатрия (1.1) кровь, центрифугируют20 мин при 400 (, После этого изпробирки сливают все слои до кольца,которое пипеткой снимают в отдельную пробирку. В нее добавляют 5-6 млсреды 199. Центрифугируют при 400 О,дважды в течение 10 мин, Надосадочную жидкость сливают, осадокресуспендируют с 0,5 мл надосадоч -ной жидкости, Во взвеси определяютколичество лимфоцитов путем ихподсчета в камере Горяева известнымметодом. Взвесь лимфоцитов разливавют в две пробирки по 0,1 мл в каждую. Б обе пробирки добавляют по0,1 мл 1-2 мкмоль раствора третичной перекиси бутила в среде 199 иставят в термостат на 30 мин при+37 С, после чего центрифугируют10 мин при 400 б, затем отбирают по0 мп надосадочной жидкости иэкаждой пробирки. В первую гробиркудобавляют О, 1 мп 0,5/ в н взвесиэритроцитов барана и ставят вхолодильник на 1 ч при +4 С (дляопределения Е-РОК). Во вторую пробирку добавляют 0,1 мл 27-нойл суспензии эритроцитов барана, обработанных мьшиным комплементом,выдерживают в термостате 30 мин пр,л+37 С (для определения ЕАС-РОК).После выдерживания обе пробиркицентрифугируют 10 мин при 50 Я реЬуспендлруют. На предметное стеклонаносят 1 каплю взвеси и под микроскопом подсчитывают число лимфоцитов, присоедищлвших не менее трехэритроцитов, и их процент по отношению к общемучислу лимфоцитов. Сравнивая количество Т- и В-клеток (7.)в пробах, полученных после обработки третичной перекисью бутила, ив пробах, где их количество опре 5 О 5 г 0 г 5 30 35 40 45 50 55 делялось известным методом, рассчитывают (/) степень снижения числа Т- и В-клеток. При снижении количества Т- и В-клеток более чем на 57 по сравнению с исходным диагностируют дефектность лимфоцитов.П р и м е р 1. У больного Б.А. из периферической вены взяли 4 мл крови, перенесли в пробирку с 0,1 мл гепарина, развели изотоническим раствором хлорида натрия 1:1. Затем наслоили на 2 мл Фиколл-верографино - вой смеси, отцентрифугировали 20 мин при 400 6. Выделенное кольцо дважды отцентрифугировали с 5 мл среды 199 в течение 10 мин при 400 Определили количество лимфоцитов в осадке. Ресуспендированную взвесь разлили по 0,1 мл в 4 пробирки. В первой и второй определили число Т- и В-лимфоцитов (Е- и ЕАС-РОК), В третью и четвертую пробирки добавили по О, 1 мп 1 мкмоль раствора третичной перекиси бутила и выдержали вотермостате при +37 С в течение 30 мин, после чего отцентрифугировали при 400 6 в течение 10 мин. Отобрали из каждой пробирки по 0,1 мл надосадочной жидкости. В полученном осадке определили число Т- и В- лимфоцитов (А- и ЕАС-РОК). Выявлено, что в не обработанной третичной перекисью бутила взвеси количество Т- и В-лимфоцитов составило соответственно 30 и 347., Во взвеси, обработанной 1 мкмоль раствором третичной перекиси бутила, число Т- и В-лимФоцитов составило соответственно 20 и 237 Число Т-лимфоцитов после обработки уменыпилось на 337 В-лимФоцитов - на 327.Диагностирована дефектность лимфоцитов, сопровождающая неосложненную острую пневмонию. Диагноз: двусторонняя очаговая бронхопневмония, острое течение.1Пример 2. УбольногоС. В. иэ периферической вены взяли 3,5 мл крови, перенесли в пробирку с 0,1 млгепарина, развели иэотоническим раствором хлорида натрия 1:1, Затем наслоили на 2 мл Фиколл-верографиновой смеси, отцентрифугировали в течение 20 мин при 400 Ц, определили количество лимфоцитов в осадке, Выделенное кольцо дважды отцентрифугировали с 5 мл среды 199 в течение 10 мин при 400 6. Ресуспендированную взвесь разлили по 0,1 мл по 4 пробир(р) Достоверность Тяжесть заболевания Здоровыедети+Лимфоциты без третичной перекиси бутила.Лимфоциты после инкуЯции с третичной перекисью бутила. 3 12600ки. В первой и второй определили число Т- и В-лимфоцитов (Е- и ЕАС-РОК).В третью и четвертую пробирки добавили по 0,1 мл мкмоль раствора третичной перекиси бутила, выдержали в тер-.5мостате при +37 С в течение 30 мин,после чего отцентрифугировали при400 0 в течение 10 мин. Отобрали изкаждой пробирки по 0,1 мл надосадочной жидкости. В полученном осадке(Е- и ЕАС-РОК),Выявлено, что в не обработаннойтретичной перекисью бутила взвесиклеток число Т- и В-лимфоцитов сос 15тавило соответственно 33 и 307. Вовзвеси, обработанной 1 мкмоль раствором третичной перекиси бутила,количество Т- и В-клеток после обра-ботки уменьшилось на 393, В-клеток - на 503.Диагностирована дефектность лимфоцитов, сопровождающая осложненнуюострую пневмонию, Диагноз: двусторонняя бронхопневмония, токсическаяформа, бронхообструктивный и кардио респираторный синдром, острое течение.Как следует из приведенных примеров,количество Т- и В"лимфоцитов впериферической крови было примерно 30одинаковым, хотя тяжесть заболевания была различной. Использованиепредложенного метода оценки дефектности лимфоцитов путем определенияпроцента снижения числа Т- и В-лимфоцитов после их обработки растворомтретичной перекиси бутила показало,что во втором случае снижение числаТ- и В-лимфоцитов было более выраженным, чтя соответствовало большей тяжести заболевания. Ис следов ания проведены у 50 де тей, больных острой пневмонией, а также у 10 здоровых детей в возрасте 1 .6 мес.Результаты проведенных исследований, а именно чувствительность Т- и В-лимфоцитов к действию перекисей при неосложненной и осложненной пневмонии (М+ш) в процентах, приведены в таблице.Как следует из данных, представленных в таблице, использование предлагаемого способа позволяет установить наличие дефектности лимфоцитов между группой здоровых детей и детьми, больными неосложненной пневмонией, в то время, как использование известного способа не поз- воляет выявить дефектность лимфоцитов между данными группами детей. Определение числа Т- и В-лимфоцитов в крови, не обработанной третичной перекисью бутила не выявило достоверных различий их уровня между группами детей, больных осложненной и неосложненной пневмонией. При применении предлагаемого способа с высокой степенью достоверности (Р0,001) выявляется дефектность лимфоцитов у детей указанных групп. Таким образом, применение изобретения позволяет повысить точность определения дефектности лимфоцитов, в частности выявить дефектность лимфоцитов при неосложненной пневмонии.Изобретение может быть использовано при диагностике пневмоний и других заболеваний, сопровождающихся нарушением иммунологической "реак- тивности организма.э