Способ определения пармидина и его метаболитов в биологических жидкостях

ае св х 4 С О 1 И 30/00, 33/15 списочник изоБРЕТЕНиЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ РЕДЕЛЕНИЯ ПАРИИДИНА ИВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИП-,инсям х а,Яа8 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Научно-исследовательскийтут по биологическим испытанических соединений(56) Вегпагй М., Вгахег Л.Т,вага Л. - З.оГ СЬгошагоВг, 19ч.152, У 1, р. 260-263,(54) спосоБ опЕГО ИЕТАБОЛИТОКОСТЯХ(57) Изобретение относится к способам анализа лекарственных препаратовв биологических жидкостях. Цель изобретения - повышение точности и чувствительности способа за счет проведения жидкостной хроматографии высокого давления в обратной фазе и элюции смесью метилового спирта, водыи уксусной кислоты в объемном соотношении (8-10):(86:88):(3,4-3,5).Спектрофотометрирование проводят придлине волны 260-264 нм,12Изобретение относится к медицине, а именно к способам анализа лекарственных препаратов в биологических жидкостях, и может быть использовано при определении концентрации пармидина и его метаболитов в крови и моче человека для оптимизации фармакотерапии при фармакокинетических исследованиях.Цель изобретения - повышение точности и чувствительности способа за счет проведения жидкостной хроматографии высокого давления в обратной фазе и элюции смесью метилового спирта, воды и уксусной кислоты.Способ осуществляют следующим образом.Образец биологической жидкости (сыворотки крови, мочи), содержащий пармидин (пиридинолкарбамат, ангинин, продектин,0 -диметилкарбамоил-(2,6-диоксиметилен) пиридин, эффективный противосклеротический преъпарат) и 4 его метаболита - 1-дезме-тилпармидин, (И-мстил, 0,0 -дикарбамоил,6-диоксиметилен пиридин), П- дидезметилпармидин (0,0 -дикарбамоил-)2,6-диоксиметилен(пиридин), 111- О-метилкарбамоил-(2,6-диоксиметилен)ппридин и 17 - (2,6-диоксиметилен) пиридин, подвергают экстракции хлороформом при рН 8. Затеи экстракт упаривают, остаток растворяют в элюенте и вводят пробу полученного раствора в хроматографическую колонку длиной 15 - 25 см, заполненную нитрилггым обратнофазным сорбентом например, "Сферисорб 5 ЯСИ", Детектирование ведут с помощью переменно-волнового спектрофотометра с проточной ячейкой объемом 8 мкл, Времена удерживания препарата и его метаболитов различны, что позволяет проводить их качественное и количественное определение, например, при условиях хроматографирования: колонка "Сферисорб 5 ЯСИ" 25 см х 4,6 мм, подвижная фаза - метиловый спирт, вода, ледяная уксусная кислота в соотношении 1(8-10):(86-88): (3, 4-3, 5) по объему при скорости элюирования 1,8 мл/мин. Времена удерживания полученных пиков препарата и его метаболитов соответственно равнялись 1 - 7,8 мин, 11 71 мин, П 1 - 3,2 мин, 1 Ч - 636 мин, Ч - 4,4 мин. На хроматограмме, полученной в результате исследования сыворотки крови и мочи челове 36366 3 5 10 15 20 25 ка, в этих условиях нет пиков эндогенных веществ в интервале 3-10 мин. Детектирование выходящих из колонки разделенных компонентов смеси осуществляют по поглощению УФ света с максимумом при длине волны 260-264 нм, ггри котором все анализируемые компоненты разделяемой смеси (1-7) характеризуются сильным пбглощением. Такой метод детектирования гарантиру= ет высокую чувствительность анализа.Содержание препарата и его метаболитов рассчитывают по калибровочным графикам обычными способами, Иинимально детектируемое количество вещества в пробе составляло 5 нг. Площадь под хроматографическими пиками могутопределятьс помощью электронного интегратора, а также Графическим методом треугольников. Показана линейная зависимость сигнала детектора от концентрации анализируемьгх веществ (1-Ч) н большом диапазоне концентраций от 5 нг до 20 мкг в 1 мл биологической пробы, Коэффициент вариации при параллельных анализах одинаковых проб 4,8 Е. П р и м е р 1. Определение концентрации пармидина и четырех его метаболитов в моче больного Н, после приема внутрь 0,5 г препарата. К пробе мочи, собранной за 6 ч после приема пармидина, объемом 0,2 мл прибавляют 0,1 мл фосфатного буфера рН 8 и 3 мл хлороформа. Экстрагируют однократно при встряхивании в течение 20 мин, затем хлороформенный слой от-. деляют, растворитель упаривают в токейазота при 45 С, Сухой остаток раство"ряют в 100 мл элюата и 50 мкл полученного раствора через мерную петлю инжектора вводят в хроматографическую колонку. Условия разделения: колонка "Сферисорб 5 БСИ", элюент СН ОН:Н О: :СНзСООН (9:87,5:3,5 об.7). Детектирование проводилось на проточном переменноволновом спектрофотометре "Алтекс 165" при 262 нм, (объем проточной ячейки 8 мкл, диапазон измерения 0,05 А на всю шкалу), Расчет хроматограмм проводили по калибровочным графикам, на оси координат которых откладывали высоту хроматографического пика, а на оси абсцисс - концентрацию вещества в стандартных растворах. При расчете было найдено следующее содержание пармидина в мочеЭ 1236366 415;3 мкг/мл, метаболита 11 - 21,4 мкг/ ф о р м у л.а н з о б р е т е н и я /мл, 111 - 1,2 мкг/мл, 1 Ч - 0,8:мкг/мл.П р и м е р 2. Определение кон- Способ определения.пармидина и его центрации пармидина и его метаболитов метаболитов в биологических жидкостях в сыворотке крови больного Н. послепутем экстракции, разделения жидкостприема внутрь 1 г препарата. ной хроматографией высокого давления,Образец сыворотки крови больного, элюции и спектрофотометрирования, отобранной через 2 ч после приема о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с внутрь 1 г препарата, подвергают экс- целью повьвпения точности и чувствитракционной процедуре и последующему 1 О тельности способа, хроматографировахроматографическому разделению ана- ние проводят в обратной фазе, в калогично примеру 1. При этом концент- честве элюента используют смесь мети- рация пармидина равна 2,3 мкг/мл, лового спирта, воды и уксусной кислометаболита 11 - 2,8 мкг/мл, 111 ты в объемном соотношении (8-10): 0,8 мкг/мл, 1 Ч - 0,1 мкг/мл. Опреде :(86-88):(3,4-3,5), а спектрофотометление концентраций проводили также рирование проводят при длине волны с помощью калибровочного графиКа. 260-264 нм.Составитель Н.Гуляева Редактор Н.Данкулич Техред В.Кадар Корректор М,СамборскаяЗаказ 3083/46 Тираж 778 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, ул.Проектная, 4.