Способ диагностики воспалительных заболеваний дыхательного тракта в фазе ремиссии

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК ЯО 122886 ПИСАНИЕ ИЭОБРЕА ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ ЕН ГОСУДАРСТВЕННЫИ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Калининский государственный медицинский институт(56) Авторское свидетельство СССРМ 1090409, кл. А 61 К 39/00, 1983.(54) (57) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ДЪХАТЕЛЬНОГО ТРАКТА В ФАЗЕ РЕМИССИИпутем определения количества спонтанных) 4 А 61 39 00 6 01 М 33 48 е-розеткообразующих лимфоцитов и неитрофилов периферической крови, отличаю- и(ийся тем, что, с целью повышения точности способа, перед определением кол ичества е-розеткообразуюших лимфоцитов и нейтрофилов лимфоциты и нейтрофилы подвергают нагрузке при нагревании до 36 - 37 С в течение 0,5 - 1,5 ч и при уменьшении количества е-розеткообразующих лимфоцитов на 5 - 3000 и одновременном увеличении количества е-розеткообразующих нейтрофилов на 5 - 3000 по сравнению с первоначальным уровнем диагностируют воспалительное заболевание дыхательного тракта в фазе ремиссии.Изобретение относится к медицине, а именно иммунологии, и может быть использовано для диагностики воспалительных заболеваний дыхательного тракта.Цель изобретения - повышение точности способа за счет нагревания клеток крови до 3637 С.Способ осуществляют следующим образом.К геперинизированной периферической крови (содержагцей 20 - -60 ед гепарина в 1 мл) добавляют ЗЯ-ный раствор жела- тины в физрастворе в количестве 1 мл на 3 мл крови. Кровь выдерживают при 37 - 38 С в течение 40 мин. Верхний лейкоцитарный слой собирают. Клетки дважды отмывают средой 199, осаждают каждый раз центри футированием при 200 и в течение 10 мин. В промежутке между отмывками оставшиеся эритроциты лизируют путем добавления 1 мл дистиллированной воды на 15 с. Готовят супензию, содержащую 1 - -5 10" клеток в 1 мл. С полученной суспензией клеток ставят реакцию В-розеткообразования В-РО в двух вариантах. Спонтанное ь-РО. К 0,1 мл суспензии клеток приливают 0,1 мл 0,6 Я-ной суспензии эритроцитов барана. Смесь центрифугируют при 200 р в течение 5 мин и инкубируют при 4 С В течение 30 мин. Осадок осторожно ресуспендируют, фиксируют путем выдерживания с 0,05 мл ЗЯ-ного раствора глутарового альдегида в течение 5 мин и отмывают дистиллированной водой, осаждая центрифугированием при 200 д в течение 5 мин. Из осадка делают мазок, который сушат на воздухе, Мазок фиксируют путем выдерживания в метаноле в течение 10 мин и окрашивают метилос 1 м зеленым - . пиронином. Просчитываю г 1.оличество В-розеткообразующих лимфоцтов на 100 лимфоцитов и В-розеткообразующих нейтрофилов на 100 нейтрофилов.В-РО после предварительной нагрузки на клетки. В пробирку вносят 0,1 мл суспензии клеток, содержащей 1 - 5 10 клеток в 1 мл. Выдерживают при 36 - 37" С в течение 0,5 - 1,5 ч. После этого приливают 0,1 мл 0,6 Я-ной суспензии эритроцитов барана.Ставят реакцию В-РО и оценивают результаты так же, как и в случае спонтанного В-РО.Для лимфоцитов и для нейтрофилов определяют разность между уровнями спонтанного ь-РО клеток и ь-РО клеток после предварительной инкубации при 37 С, т. е, уровней в-РО лимфопитов, полученных по первому и второму вариантам и уровней В-РО нейтрофилов, полученных по первому и второму вариантам. Если количество В-РО лимфоцитов уменьшается на 5 ЗОЯ и при этом количество в-РО нейтрофилов увеличивается на 5 - ЗОЯ, то диагностируют ремиссию хронического бронхита. 5 (О 5 20 25 30 35 40 45 50 55 Нижний предел колсбанй розеткообразующих Т-лимфоцитов и нсйтрофилов (5 г) дан с тем расчетом, что нижняя цифра должна превы 1 пать ошибку одного измерения, составляющую не более 5 Д- а верхний исходя из изменений данно 1 о параметра у больных хроническим брох 11 гом.Пример 1. Рабочая Н. Е., 42 1 ода, обследована амбулаторно в период диспансеризации. Для иммунологического обсл;дованя у больной взяли 4 мл крови из локтевой 1 зены в пробирку, содержащую 0,5 мл раствора гепарина (в концентрации 200 ед,мл,1. Кровь перемешивали с 1,3 мл ЗЯ.ного гаствора желатины и ВыдержиВа.и д,я )ассла иваня при 37 С в течение 40 мин. Верхний лейкоцитарный слой отбирали. Б пробирку, содержащую лей кс ц итар ны й слой, пр л и вал и среду 199 до обьема 1 О мл, перемешивали Клетки осаждали цептрифугированием .1 ри 400 С В течение 10 мин. Надосадоч 11 ую жидкость сливали, осадок ресуспендиронали. Для лизиса оставшихся эритроцитов к осад. ку добавляли 1 мл дистиллированной воды. выдерживали 15 с. затем доливали срсду 199 до объема 10 мл. Клетки осаждали центрифугированием. Надосадочную жидкость сливали, осадок ресуспендировали. К гсадку приливали среду 199 В гаком количестве, чтобы концентрация клеток ь с 1,с.:1 ензии составила 1 - -5 10" в 1 мл.С полученной суспснзией став 1:.Ли реакцию В.РО в двух вариантах.К 0,1 мл полученной суспгнзии клеток приливали 0 1 мл 0 6/-ной сус 11 ензии эритроцитов барана, цснтрифугировали при 200 С 5 мин, инкубировали при 4-С 30 мин, осадок ресуспендировали, добавлял 0,05 мл глутарового альдегида (ЗД-но 1 о раствора), с которым выдерживали В течение 5 мин, приливают дистиллированную Воду до объема 10 мл, центрифугировали нри 200 ц 5 мин, делали мазок. Мазок фиксипонал 1 В метаноле, окрашивали метиловым зеленым -- пиронином и затем просчитывалн кол 1 ество розеткообразующих клеток.По второму варианту О, 4,1 полученной суспензии клеток инкубирова,1 и при 37" С в течение 0,5 ч. После этого к суспензии приливали 0,1 мл 0,6 Я-НОЙ с;цензэритроцитов барана и ставили рсак 1:кз е-РО аналогично первому Варантъ.Данные подсчета уровней розеткообра- :1 У 101 ЦИХ КЛЕТОК ПОЗВОЛИЛИ 1 ЗЬ 51 ВИТЬ СЛЕДЮ- гцее. Уровень спонтанных е-РО 1 имфоцитов составил 81 Я, В-РО нейтрофилов -- 9 Я. Эти поазаели находятя В и)сдс.1 ах нормы, поэтому на основании них (т. е. на основании определения только уэОВня спонта 11 ных 11-розетс 1 К) к какому-либо определс 1 знсму 1 зыводу прийти трудно. У этои жс больной после предварите,1 ьной;1 агрузки на кл тки 1 з виде инкубации при 37"С В тече:1 ие 0,5 ч уровень В-РО лимфоцитов составил 5 Д, е,-РО нейтрофилсв - 32, Слсдогзатсльно,1228863 Составитель Г. Крюкова Редактор О. Бугир Техред И. Верес Корректор Л. Обруча р Заказ 22094 Тираж 660 Г 1 одписное ВНИИХИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий13035, Москва, Ж 35, Раунская наб д. 45 Филиал ПГ 1 ППатент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4в результате нагрузки на клетки количестго в-РО лимфоцитов у данной больной снизилось на 29 Я, а количество -РО цейтрофилов повысилось на 13 Я, чтосоответствуег диагнозу воспалительных заболеваний дыхательного тракта в фазе ремиссии. Клиническое5 обследование подтвердило диагноз - хронический бронхит в фазе ремиссии. Больной было рекомендовано, а затем осуществле 11 о профилактическое лечение с применением ингаляций раствором левамизола. 1 ОПовторное обследование той же больной было осуществлено спустя 6 мес после курса профилактического лечения. В результате этого обследования было выявлено, что х ровень спонтанных В-РО лимфопитов составил 65 Я, в-РО нейтрофилов - 25 Я, т. е. также в пределах нормы. В результате нагрузки в виде инкубации клеток в течение 0,5 ч при 37 С уровень -РО лимфоцитов составил 68 Я, уровень е-РО нейтрофилов -- 30 Я, т. е. по сравнению со спонтанным коли ести20 в-РО лимфоцитов увеличилось на 3,", количество в-РО нейтрофилов увеличилось на 5,г, что соответствует состоянию нормы.оВ течение 6 месяцев после курса профилактического лечения у больной не наблюдалось ни одного обострения хронического бронхита, 25 клиническое обследование также подтвердило существенное улучшение состояния оольной.Пример 2. Больной В. С., 45 лет, обследован амбулаторно в период диспансеризации.Им мунологическое обследование больного 30 осуществляли аналогично примеру 1. Исключение составило лишь время инкубации клеток при 37 С перед постановкой реакции РО (второй вариант постановки реакции е-РО): клетки ицкубировали при 37"С В течение 1,5 ч.35Данные иммунологического обследования следующие: уровень спонтанных -1 зО лимфоцитов составил 72/, в-РО цейтрофилов - 33 о( что находится в пределах нормы.После предварительцой нагрузки в виде инкубации клеток при 37 С в течение 1,5 ч уровни в-РО лимфопитов составили 59 ф, В-РО нейтрофилов49 Я, т. е. у)Овнц е-РО лимфоцитов понизились на 1 Зо уровни В-РО нейтрофилов повысились на 6 о 4 (в результате инкубации клеток в течение 0,5 ч 45 у того же больного уровни В-РО лимфонитов по сравнению со спонтанными снизились на 15 г, уровни в-РО нейтрофилов повысили,.ь на 18/). Это соответствовало диагнозу, поставленному больному в резхльтяте подробного клинического обследования: хронический бронхит В фазе ремиссии. Больному было Г 1 екомедовацо, а затем осхществлецо профилактическое лечение путем ингаляций масляным раствором стафилококковой вак 11 и ц ь11 овторное им м х цол огическое обследованиее больного этим же способом спустя 6 мес. показало, что уровень спонтанных е-РО лнмфоцитов составил 75 Я, е-РО нейтроф илов - 28 Я. В результате нагрузки в Виде ицкубании клеток в течение 1,5 ч цри 37" С уровень е-РО лимфопитов (е-РОЛ) составил 60%, е-РО нейтрофцлов (е-РОН) - 35%, т. е. уровни В-РО,г 1 повысились на 15 ог, уровни е-РОН повысились ца 7 Я, что соответствует статусу хронического бронхита В ремиссии. Подробное клицицеское обследование подтвердило постаьленный диагноз. Зя период, прошедший с момента первого обследования, у больного дважды отмечалось обострение хронического бронхита. редлагаемый сносок: позволяет выявить дог товерные разл иция разностей уровней е-РО лимфо 11 итов ц -РО еитрофилов после инкубяции клеток цри 3637 С (в течение 0,5 1 ли 1,5 ч) и спонтанных г-РО, причем эти ре 1 зличия явля 1 отся не только достоверными, цо и существенными. Вместе с тем ряз.1 и 1 и 51 В Ве,1 ицине разности (спонт 11 цные в-РО клетки е-РО клетки) пос,1 е пГименения:11 грхзки у здоровых и больных хроническим бронхитом в фазе ремиссии наиболее четко проявились в результате инкубациц клеток при 36 - 37"С. Г 1 ри более низкой температуре ицкубаццц (35 С) различия в уровнях данных параметров проявились более слабо. В результате ицкубаниц прц 38 С ухудшалось качество препаратов, поскольку клетки деформировались, что затрудняло оцНкх результатов. Следовательно, оптимальной температурой для инкубации клеток является 36 - 37"С. Применение этой температуры позво,1 яет выявить максимальные рял,ици 51 В у 1 ОВнях пязяхет)зов В группах при хорошем кацестве препаратов.Тякич образом предлагаемый способ позволяет повысить точность диагностики в 00",; случаев, поскольку согласно известномх способу осуществлять диагностику было невозможно.