Способ определения полифенольных соединений

(59 4 А 61 К 35/78 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Иркутский государственный медицинский институт(54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛИ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ путемизвлечения их из растительного сырья с пос 801215708 А ледующим фотометрическим определением суммы флавоноидов, отличающийся тем, что с целью упрощения способа, извлечение проводят 48 - 52%-ным этанолом, сумму полифенольных соединений определяют перманганатометрическим титрованием, затем осаждают дубильные вещества, определяют в фильтрате сумму флавоноидов и фенолкарбоновых кислот, а содержание дубильных веществ определяют по разности между суммой полифенольных соединений и суммой флавоноидов и фенолкарбоновых кисИзобретение относится к фармакологии, а именно к способам определения полифенольных соединений.Цель изобретения -- упрощение способа.Пример 1. К 2 г воздушно-сухого сырья лапчатки кустарниковой добавляют 50 мл 50/0-ного этанола при нагревании на водяной бане в течение 30 мин, извлечение ведут до истощения сырья, контролируя полноту извлечения. Полученные вытяжки после объединения и отгонки спирта сгущают, фильтруют, очищают хлороформом от пигментов и смол. В экстракте, разбавленном 50/0-ным этанолом до 250 мл, определяют сумму полифенолов перманганатометрическим методом. Для этого к 10 мл извлече ния приливают 25 мл индигокармина, 750 мл дистиллированной волы и титрукт 0,1 н. раствором перманганата калия до соломенно-желтого цвета. В контролируемую пробу вместо извлечения добавляют 10 мл 500/0-ного этанола, расчет ведут по формуле:а - Ь) КЭС ЮОхН Чгле х - количество полифенольных соедине.ний, 0/0;а - количество 0,1 н. раствора КМп 04,пошедшего на титрование, мл;Ь - количество 0,1 н. раствора КМпО,пошедшего иа контрольный опыт.мл;К - поправка на титр по щавелевой кислоте;Р - коэффициент пересчета на танин,равный 0,0058;С - общий вес экстракта;Н - навеска, г;Ч - количество экстракта, взятое длятитрования, мл.Затем дубильные вещества в извлечении осаждают добавлением 5/0-ного желатина, отстаивают извлечение с осадком при 3 4 С в течение трех дней, фильтруют и определяют в фильтрате сумму флавоноидов и фенолкарбоновых кислот титрованием. Количество дубильных веществ рассчитывают по разности между суммой полифенолов и суммой флавоноидов и фенолкарбоновых кислот. В лапчатке кустарниковой сумма полифенолов составляет 11,60/0, сумма дубильных веществ 6,890/0.Содержание флавоноидов определяют фотоэлектроколориметрически, к 2 мл извлечения прибавляют 2 мл 2/0-ного раствора хлористого алюминия в 50/0-ном этаноле, через 2 мин добавляют 2 мл 100/0-ного раствора ацетата натрия и через 1 мин проводят фотоэлектроколори метри рова ние с си ни м светофильтром. Калибровочный график строят по кверцетину. В данном случае сумма флавоноидов составляет 3,80%, фенолкарбоновых кислот 0,81%. Пример 2. Из 2 г воздушно-сухого сырьялапчатки пижмолистной получают извлечение с помощью 500/0-ного этанола при нагревании на водяной бане с обратным холодильником в течение 30 мин. Зтанол берут в количестве 50 мл. Процесс извлечения ведут до истощения сырья. Полноту извлечения проверяют качественной реакцией на дубильные вещества (с железо-аммониевыми квасцами) и бумажно-хроматографическим методом (на флавоноиды и фенолкарбоновые кислоты).Полученные вытяжки после объединенияи отгонки спирта сгущают, фильтруют и подвергают очистке с помощью хлороформа от пигментов и смол.Очищенный экстракт разбавляют 50/0 ным этанолом до метки в колбе на 250 мл и определяют количественное содержание .суммы полифенолов перманганатометрическим методом.20 Для этого берут из колбы 10 мл извлечения, помещают его в колбу емкостью 1 л, приливают 25 мл индигокармина, 750 мл дистиллированной воды и титруют 0,1 н.раствором перманганата калия до соломенно-желтого цвета.Параллельно ставят контрольный опыт,определяя таким образом индиго-число. Для проведения контрольного опыта вместо извлечения берут 10 мл 500/0-ного этанола, разбавляют его 750 мл дистиллированной воды з 0 и титруют 0,1 н. раствором перманганатакалия в присутствии индикатора индигокармин (25 мл).Расчет ведут по формуле(а-Ы к Э с 10 охН Чгде хколичество полифенольных соединений, 0/0;а - количество 0,1 н. раствора КМпО,пошедшего на титрование, мл;Ь - количество 0,1 н. раствора КМпО,пошедшего на контрольный опыт,мл:,К - поправка на титр по щавелевой кислоте;Р -- коэффициент пересчета на танин,45 равный 0,00582;С - общий объем экстракта;Н -- навеска, г;Ч - количество экстракта, взятое для титрования, мл.После определения суммы полифеноловизвлечение очищают от дубильных веществпутем осаждения их 50/0-ным раствором желатина. Дубильные вещества при этом выпадают в осадок. Затем извлечение с осадком отстаивают при 3 - 4 С в течение трех55 дней, фильтруют. В полученном фильтратеопределяют сумму флавоноидов и фенолкарбоновых кислот титрованием и расчетыведут по указанной формуле.1215708 Составитель Н. Гуляева Техред И. Верее Корректор А. Зимокосов Тираж 659 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам нзобретений и открытий13035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4Редактор Н. ДанкуличЗаказ 924/4 Количество чистых дубильных веществ определяют по разнице между всей суммой полифенолов и суммой полифенолов, освобожденных от дубильных вешеств (т.е. суммой флавоноидов и фенолкарбоновых кислот). Так, если общая сумма полифенолов в лапчатке пижмолистной составляет 12,47%, сумма полифенолов после осаждения дубильных веществ 4,42%, то сумма чистых дубильных веществ составит 8,05%.Количественное содержание флавоноидов определяют фотоэлектроколориметрическим методом в извлечении, оставшемся после исследования суммы полифенольных соединений, очищенном от дубильных веществ.Для этого в сухую пробирку наливают 2 мл извлечения, прибавляют 2 мл 2%-ного раствора хлористого алюминия (на 50%-ном этаноле), через 2 мин добавляют 2 мл 10%-ного раствора ацетата натрия (тоже на 50%-ном этаноле). Через 1 мин определяют светопоглошение раствора с помощью фотоэлектроколориметра (ФЭКм). Измерения проводят по черной шкале при синем светофильтре в кюветах на 5 мл. В качестве контроля используют раствор, полученный смешиванием 2 мл извлечения с 4 мл 50%-ного этанола. Расчеты проводят по калибровочным графикам, построенным для флавоноидных соединений, преобладающих в сумме.В лапчатке пижмолистной преобладает глинозид кверцитрин, поэтому расчеты проводят по графику этого соединения.Содержание фенолкарбоновых кислот устанавливают по разнице между суммой полифенолов, очищенных от дубильных вешеств, и суммой флавоноидов.Сумма чистых дубильных веществ лапчатки пижмолистной составляет 8,05%, сумма флавоноидов 3,05%, следовательно сумма фенолкарбоновых кислот равна 1,37%.Пример 3. Из 2 г. воздушно-сухого сырья лапчатки м ногаи адрезанной получают извлечение с помощью 50%-ного этанола при нагревании на водяной бане с обратным холодильником в течение 30 мин (дальнейший ход определения по примеру 1).Обшая сумма полифенолов в лапчатке многонадрезанной составляет 6,82 й, сум 5 О 15 20 25 30 35 40 ма полифенолов после осаждения дубильных веществ 3,49/о. следовательно сумма чистых дубильных веществ составляет 3,33%.Количественное содержание флавоноидов определяют фотоэлектроколори метрическим методом (пример 1), Расчеты проводят по калибровочным графикам, построенным для флавоноидных соединений, преобладающих в сумме. В лапчатке многонадрезанной преобладает агликон кверцетин, поэтому расчеты проводят по графику этого соединения. Содержание фенолкарбоновых кислот определяют по разнице между суммой поли- фенолов, очищенных от дубильных веществ, и суммой флавоноидов.Сумма чистых дубильных вешеств лапчатки многонадрезанной равна 3,33%,сумма флавоноидов 2,45%, следовательно сумма фенолкарбоновых кислот составляет 1,04 о,о.Пример 4. Из 2 г воздушно-сухого сырья (сырьем является трава) горца перечного получают извлечение с помошью 50%-ного этанола при нагревании на водяной бане с обратным холодильником в течение 30 мин (дальнейший ход определения по примеру 1).Общая сумма полифенолов в траве горца перечного составляет по данным 6,97%, сумма полифенолов после осаждения дубильных веществ 2,77/ следовательно сумма чистых дубильных веществ равна 4,20%.Количественное содержание флавоноидов определяют фотоэлектроколориметрическим методом (пример 1). Расчеты проводят по кзлибровочным графикам, построенным для флавоноидных соединений, преобладающих в сумме. В горце перечном преобладает флавоноидный гликозид рутин, поэтому расчеты проводят по графику этого соединения.Содержание фенолкарбоновых кислот определяют по разнице между суммой поли- фенолов, очищенных от дубильных веществ и суммой флавоноидов. Сумма чистых дубильных веществ горца перечного равна 4,20%, сумма флавоноидов 1,82 о/о, следовательнс сумма фенолкарбоновых кислот составляет 0,95%.