Способ получения полисахаридов, обладающих противоопухолевым действием

пи майИЗОБ Союз Советскихп 1)704431 ТЕН И(31) 80665/7 по делам нзооретеннй и открытий(Япония) 2) Авторы изобретения о Уэно, Чи ихико Вад Иностранная фирма реха Кагаку Когио Кабусики Ка(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИСАХАРИДОВ, ЛАДАЮЩИХ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫМ ДЕЙСТВИ Грибы род исслеловатсльс Агенстве технелющим обр Грибы рода Сог 1 оцз подвергают сначала зкстрагированию водой или водным раствором, содержащим небольшое количество щелочи (разбавленный щелочной раствор), а затем последующему экстрагированию в несколько сталий с использованием водных растворов с постепенно возрастающей концентрацией щелочи, концентрация растворов должна быть не выше 2 н. Водные растворы, используемые лля зкстрагирования применяют в количестве от 5 до 200 раз превышающие по весу исходный материал в каждой стадии экстрагирования. Экстрагирование проволят при 50 в 100 С в течение от 20 мин ло 5 ч.Число стадий зкстрагирования от 2 до 10, предпочтительно 3 - 8. Общее время нагревания должно быть менее чем 20 ч (независимо от стадий экстрагирования). Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается полученияпротивоопухолевых препаратов.Известен способ получения полисахаридов. обладающих противоопухолевым действием, путем экстракции грибов горячей водой с последующим выделением и очисткойцелевого продукта 11. Однако при известном способе выход целевого продукта достигает 2,4%.Целью изобретения является повышениевыхода целевого продукта.Эта цель достигается тем, что экстракции подвергают грибыСопоцз егясоог (Гг,) (;1 це 1,Сопо 1 цз 1 т 1 гзц(цз;(Гг.) Яце 1,Сого 1 цз сомзогв (Вегк) )гпагСопоиз соисИег (ЬсЬч.) Рат.,Сопо 1 цз ривезсепз (Рг.) (;)це,Сопопз рагдагпепцз (Гг.) Рат.,Сог 1 о 1 цз в 11 огптв (К)отг,) Ра(.,а затем осуществляют повторное многократное экстрагирование водным раствором щелочи с постепенно возрастающей концентрацией, не превышающей 2 Х. Кроме того, повторное экстрагирование осуществляют 3 - 8 раз,2Сопоцв хранятся в научноом институте ферментов в ических наук и технологии ния).цествляют с, а 7044311 ачсствс щелочи используют гидро- окиси натрия, кашя, кальция или аммония.Рс ; экстрагирование проводить с исннипаР 1 С.-(1 Высоко концетрированных ВОдных елочных растворов с самого начала бзредварительногороведения водного экстрагирования, вы:(од экстракта очень Высока первой стадии экстрагирования, но резко падает на второй и последующих ста яхПолученный экстракт нейтрализуют обыч;ым мсто,.ом с использованием разбавленкй соляной кислоты, а затем подвергают рафипироваию.Могут быть разлчыс методы рафинирования, такис как уьтрафильтрация, реверс;вньЙ осмос, гельфильтрация, высаливанис, которые могут быть использованы по О 1 десьности или в комбинации друг с другом.Злемснтарный анализ полученого полисахарида показывает, что поисдхарид состоит из углерода, водорода, азота и кислорода.Молекулярный вес полисахаридааходится в пределах от 5000 до 300000, средий молекулярный вес находится В дваа- зоне от 10000 до 100000. Фракции с низким молекулярным весом (меньше 5000) обладают почти нулевым ингибиторым действием против саркомытвердых оухолей на мышах при внутримышечном введении, а также они имеют горечь. неприятный запах и побочные действия.Полясахариды, полученные предлагаемымм способом, оказывают противоопухолевое действие на мышей не только при внутри- мышечном введении, но и при пероральном ввсдснии. 1 О,1 исахаридыс вызывают соочпых действий в ХРмиотерапии рака и увеличивают чувствительность к радиотерапии, предотвращают инфекционные болезни, вызываемьс Вирусами или бактериями, при пероральном внес;ии улучшают жизненные функции, улучшая аппетит, работу кишечника.Пример 1. 200 г сухой мицелы (содержание влаги 9,9%) кориолуса разноцветного (Гг,) (,)пе 1. (ГЕКМ-Р 1 х)0.2414), полученной из искусственной культуры, и 3 л воды помешают в сосуд емкостью 5 л, снабженный мешалкой. Смесь перемешивают на кипящей водной бане и выдерживают при этих условиях в интервале температур 95 + 2 С в течение 3 ч. Затем смесь охлаждают и подвергают отсасывающей фильтрации путем использования воронки Бюхнера для разделения грибов и экстракт-раствора, затем Осажденный мицелий промывают 1 л воды и смешивают с экстракт-раствором. Смешанный раствор составляет около 3,5 л, рН экстракт-раствора 5,8. Оставшуюся мицелу затем снова смешивают с 2 л воды, затем подвергают примерно ,Вухчасовой экстракции и промьванию 1 л воды до Олучения 3 л экстракт-раствора. Конечный грибной ОстР 1 ток снсв 11 смешР 1 ают с 2 л О,н. рас Вора идпоокиси натрия и 10 добны,",1 же ОО- разом экстагируют при 95:2=С в течение 2 ч с последующим охлаждением, ейтрализацией 2 К соляной кислотой и отсасывающей фильтрацией для отделения экстракт-раствора и остатка грибов. После отделения остаток промываютсм" воды и смешивают с экстракт-раствором до получения 2,5 л раствора.Подобные операции повторяют с исользоваием 2 л 0.2., 0,3. и 0,4 н. растворов гидроокиси натрия и 0,5 л 1".ромывой воды до получения 2,5 л экстракт-раствора пз каждого процесса.Эти есть порций экстракт-раствора (общее количество 16,5 л) сливают вместе и концентрируют Вакуумным концентратом (роторый испаитель) при 60 С до 700 см и затем помещают в целлю.юзную трубку для диализа при действии тока диализа при 5 С в течение 72 ч, и полученный диализат затем концентрируют и подвергаЮт сушке вымораживанием до получеия 60 г коричневого порошка с содержанием влаги 7% (выход 31.1%), Элементарный анализ этого порошка дает 40,3% углерода, 6,2% водорода, 2,9% азота и 50,6% кислорода. Молекулярный Вес этого Вещества, орсделенный на хроматограф 11 Сской колонке, приб.;Изитсль., 10000 -250000, а средний молекулярный вес, определенный с помощью метода ультрастрифуги с использованием Воды в качестве ПасВорителя,94000.Опыты показали. что порошкообразное вещество -- это азотсодерж ший полисахарид. Ингибирую 1 Рес ействе э гого Вещетва против Саркомы; Вспдых опххолей на мышах было Высоким, равым 90% при внутримышсч 11 ом введии 70% 1 ри введении первраль 1 О,Противооп; холевое действие этого вещества определяют с помощью обы .ного метода. Опухоли клети саркомапересаживают в брюшнук 1 полость мышей после интенсивного роста в течение 7 дней, 10 этих клеток пересаживают под кожу влагалища других мышей для образования твердых опухолей. При внутримышечном введении препарат дают в дозе 10 мг/кг один раз каждый день в течение 20 дней при общей дозе 0,2 мл на 20 г (веса мыши), а при пероральном введении полисахарид дают в дозе 1,000 мг/кг один раз в день В течение 20 дней при общей дозе 0,2 мл/20 г (веса тела мыши). Опухоли образуют ядро на 25-й дснь после пересаживания, а задерживание роста опухоли в процентах подсчитываюткак отношение среднего веса опухоли в мышах, которое дает полисахарид, и среднего веса опухоли в контрольных мышах.Результаты подобного рода опытов экстракции, проводимые с использованием только одной воды в качестве растворителя, показаны ниже в табл. 1. В этих опытах все стадии экстракции и промывания осуществляют путем использования воды в тех же количествах, в которых используют растворитель при упомянутой выше обработке. В этом случае экстракт-раствор (смешанный с промывной водой) подвергают концентрированию с помощью вакуума, диализу, охлаждению и сушке, чтобы определить выход в каждой стадии экстрагирования. Эти результаты показаны в таблице. Из этой таблицы очевидно, что выход при экстрагировании резко падает во 2-й и последуюших стадиях экстраги рования.Пример 2. Используя ту же самую аппаратуру, как и в примере 1,200 г сухой мицелы (содержание влаги 8,8%) кориолуса разноцветного (Гг.) Яце (ГЕКМ-Р МО. 2414) экстрагируют с помошью 2 л 0,05, 0,1, 0,2 и 0,4 н. растворов гидроокиси натрия. Температура экстрагирования 90 - 95 С и время экстрагирования составляет 2 ч в каждой стадии экстрагирования, После каждой стадии экстрагирования смесь охлаждают, нейтрализуют 2 Х раствором соляной кислоты, а затем подвергают отсасывающей фильтрации для разделения осадка грибов от экстракт-раствора. Осадок промывают 500 см воды после каждой стадии экстрагирования, и промывной раствор смешивают с соответствующим экстракт-раствором.Экстракт-раствор на каждой стадии экстрагирования подвергают вакуумному концентрированию, диализу, концентрированию в сушке вымораживанием таким же образом, как это делают в примере 1, до получения коричневого порошка.Результаты экспериментов по получению продукта в соответствующих стадиях экстрагирования показаны ниже в табл. 2. Обший выход 27%, элементарный анализ каждого продукта, %, углерод 41,0; водород 6,3; азот 3,7; кислород 49,0.Определено, что вышеупомянутый порошок в азотсодержашем полиеахариде имеет молекулярный вес от 10000 до 250000, а средний молекулярный вес 100000. Соотношение, оказывающее ингибиру юшее действие против Саркомытвердой опухоли, на мышах 93% при внутримышечном введении и 73/, при пероральном введении.Для сравнения выхода при экстрагировании такие же эксперименты, как в примере 1, были проведены с использованием 1 н. и 0,4 н. растворов гидроокиси натрия с получением результатов, приведенных ниже в табл. 3. Как следует из таблицы, выход па Ингибируюший эффект этого вешества против твердых опухолей саркомана мышах оказался высоким и составляет 94% при вынутримышечном введении и 68% при пероральном введении.Пример 4. Используя аппаратуру, такую же, как в примере 1, 200 г сухих плодовых тел Кориолуса разноцветного (Гг.) Яие( (ГЕКМ-Р ХО.2414) с содержанием влаги 8,70/, первоначально подвергают экстрагированию с помошью 2,4 л воды при 95+. :-2 С в течение 3 ч. Продукт после охлаждения подвергают отсасываюшей фильтрации для разделения осадка и экстракт-раствора, затем осадок промывают 500 см водь 1, и промывные воды смешивают с экстракт- раствором, получив, таким образом, около 2,5 л экстракт-раствора.Осадок затем смешивают с 2 л 0,4 н. раствора гидроокиси натрия и подвергают экстрагированию при 90+.2 С в течение 1 ч, охлаждают, нейтрализуют 2 Ч раствором ФО 1 21 2 36 3 И дает, когда экстрагирование повторяют при использовании экстракт-раствора той же самой концентрации, и очень трудно получить высокий выход, такой же,как при многостадийном экстрагировании. Памер 3. Используя аналогичную аппаратуру, как в примере 1, 200 г сухой мицелы (содержание влаги 9,9%) кориолуса разноцветного (Гг) Яце. (ГЕРМ-Р МО. 2414) подвергают первичному экстрагированию Зл воды при 95+ 2 С в течение 3 ч, а затем после охлаждения подвергают отсасываюшей фильтрации для разделения осадка мицелы и экстракт-раствора, осадок мицелы затем промывают водой в количестве 1 л и затем смешивают с экстракт-раствором с получением 3,5 л экстракт-раствора.Затем к осадку добавляют 2 литра 1 н. раствора гидроокиси натрия для экстрагирования при 90 - 95 С в течение 0,5 ч, раствор затем охлаждают, нейтрализуют 2 Х соляной кислотой, подвергают отсасываюшей фильтрации, промывают 1 л воды. В результате этих операций получают 3 л экстракт- раствора и остаток грибов.Все экстракт-растворы, полученные в результате проведенных операций, смешивают вместе и подвергают вакуумному концентрированию, диализу, дальнейшему концентрированию и сушке вымораживанием таким же образом, как в примере 1, в результате чего получают 33 г коричневого порошка с содержанием влаги 7% (выход 21,0/,). Результат элементарного анализа этого порошка показал, что порошок состоит из 41,7% углерода, 6,4% водорода, 3,9% азота и 48,00/О кислорода, Было обнаружено, что это вещество - азотсодержаший полисахарид с молекулярным весом от 10000 до 300000 и средним молекулярным весом 98000..0,4 ество оличество мицел, используемое как сходный материал 200 г; темпераура екстрагирования 95 - 2 С,о а блица ыход суого пороша, вес/% О,О 0 11,5 12,5 0 6,6 соляпои кислоты, подвергаю г 0 сасывающей фильтрации и промывают 500 смз воды, в результате чего получают 2,5 л эк стракт-раствора и осадок. Подобную операцию экстрагирования повторяют с 2 л 1 н. раствора гидроокиси натрия при 80.+2 С в течение 1 ч, в результате чего получают 2,5 л экстракт-раствора.Все экстракт-растворы сливают вместе и подвергают концентрированию под вакуумом, диализу, концентрированию и сушке вымораживанием таким же образом, как в примере 1, при этом получают 43 4 г коричневого порошка с содержанием влаги 7,5% (выход 22%). Результат элементарного анализа этого порошка показал каличие 42,3 / ,тлерода, б,о",0 водорода, 2,2 азота и 49,0; кислорода. Порошок представляет собой азотсодержащий полисахарид с молекуляпным весом 110000.Ингибрирующее действие этого вещества против твердь;х опухолей Саркомана мышах высокое и равно 96 ц/ю при внутри- мышечном введении75% при пероральном введении.Для сравнения величин выхода подобный процесс экстрагирования был проведен с использованием только одной воды в качестве растворителя. Выход порошка в этом случае был всего только ,б/.Предлагаемый способ обеспечивает высокий выход целевого продукта до 31,1/,.704431 1 О Таблица 3 13,8 2,9 3 4 бщий выход 20,2 Формула изобретени идов, обйствием, водой с ой целечто, спродукгократом ще- центрайся тем, ществляСоставитель С. Мал Текред М. Левицкая Тираж 672ственного комитета бретений и открыт - 35, Раушская набг. Ужгород, ул. ректор Н. Стецписное Редактор Л. НовожиловаЗаказ 7828/48ЦНИИПИ Г СССР ийд. 4/5 Проектная осуда по делам изо 113035, Москва, Ж илиад ППП кПатент1. Способ получения полисахарладающих противоопухолевым дпутем экстракции грибов горячейпоследующим выделением и очиствого продукта, отличающийся тецелью повышения выхода целевогта, экстракции подвергают грибы Сог 1 оцз чег 51 со 1 ог (Гг.) Яце 1, Сог 1 оцз Ь 1 гзц 1 ц 5 (Гг.) Яце, Сог 1 о 1 цз соцвогз (Вег 1) 1 гпаг. Сог 1 оцз соцсЬ 11 ег (ЬсЬь.) Ра 1 Сог 1 о 1 цз рцЬезсепз (Гг.) Яце 1,пц 5 (Гг.) Ра 1 (К 1.о(г.) Ра 1 т повторное м водным раств зрастающей к ей 2 М.1, отличающ гирование осу Сог 1 о 1 цз рагдатпе Сог 1 о 1 цз Ь(оггп 15 а затем осуществляю ное экстрагирование лочи с постепенно во цней, не превышающ2. Способ по п, что повторное экстра ют 3 - 8 раз. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Заявка Японии50-32304, кл. 30 А 3опублик. 1975.