Способ определения качества половых продуктов у самцов карповых рыб

(19 К 61 0 И АНИ ВТОРСКОМУ ЕТЕЛЬСТВУ судар- вченко и льЛЕНИЯ КАЧЕСТВ АМЦОВ .КАРПОВЫХ отбор пробы изучениена ть, о т - .ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(.71) Киевский ордена Ленина гоственный университет им Т.Г.Ше(56) Макеева А.П. и Белова Н.В. Продуцирование и качество спермы прискусственном разведении раститеноядных рыб. - Рыбное хозяйство,1975, У 7, с. 17-20.Белова Н.В. Эколого-.физиологические особенности спермы прудовыхкарповых рыб.Вопросы ихтиологии,т. 23, в. 1, 1983, с. 87-95.(54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕ АПОЛОВЫХ ПРОДУКТОВ У С.;РЫБ, предусматривающийспермы и последующее еефункциональную активнос л и ч а ю щ и й С я тем, что, сцелью повышения .точности диагностики степени зрелости и качества сперматозоидов, отобранную пробу подвергают гомогенизации в сахарозном буфере с последующим центрифугированием, обработкой осадка в буфере вприсутствии тритона Х, трехкратной отмывкой от тритона Х чистым буфером и экстрагированиемгистонов из осадка ядер в 0,4 н, НС 1,после чего гистоны высушивают, подвергают электрофоретическому анализув полиакриламидном геле, гели окрашивают и проводят элюирование краски из полос субфракций 111, н Н 1в 17-ном додецилсульфате натрия,количество которой измеряют по поглощению при= 590 на спектрофотомере, а функциональную активностьспермы определяют по соотношениюфракций 11, /Н 1, при этом к зрелымотносят сперматозоиды, у которыхсоотношение Н 1,( 111 а составляет 3:1.Изобретение относится к области биотехники разведения рыб, в частности к способам определения качества половых продуктов у самцов карповых рыб, и может быть использовано в процессах селекции и промьппленного разведения рыб.Целью изобретения является повышение точности диагностики степени зрелости и качества.сперматозоидов.На чертеже изображено накопление субфракции гистона Н 1(Н 1) в сперматогенезе белого амура: а - гистоны тимуса теленка (контроль), 6 - незре" лые семенники, в - зрелые семенники белого амура, г - смерматозоиды, д - печень белого амура (контроль).Способ позволяет получить объективные показателиспермы рыб и своевременно обеспечить хозяйства рыбопосадочным материалом, что при разведении растительноядных рыб повысит качество продукции на 10-127.Важным преимуществом способа является также то, что анализ основан на определении генетически обу-словленного и легко измеряемого признака (накопление конкретного белка), что позволяет проводить. сравнение различных производителей в разные периоды их жизни, т.е. рыб, отличающихся по возрасту, что весьма важно для рыбоводной практики и селекционной работы с рыбами,Способ осуществляется следующим образом.Сперматозоиды карповых рыб фиксируют в этиловом спирте. Перед выделением ткань взвешивают. Пробу гомогенизируют в буферном растворе, содержащем 0,25 М сахарозы, 10 мМ трис-НС 1, рН 7,5, 10 мМ МдС 1, 25 мМ КСГ и 25 мМ Ма Я 0. Гомогенат центрифугируют при 3000 я 15 мин, осадок обрабатывают 0,57.-ным тритоном Хв буферном растворе и затем отмывают от тритона Хф трехкратной промывкой ядер в буферном растворе, Затем ядра заливают 0,4 н. НС и экстрагируют гистоны в течение 4 ч при 4 С. После центрифугирования при 3000супернатант заливают трихлоруксусной кислотой до конечной концентрации 18 Х. Гистоны осаждают в течение 24 ч при 4 С, затем осадок собирают центрифугированием, промывают один раз подкисленным (0,25 н. НСГ) ацетоном и трижды - чистым ацетоном, после чего гистоны высушиваютпод вакуумом, "Электрофорез проводят в 57-номполиакриламидном геле, содержащем0,1 Е додецилсульфата натрияГелиокрашивают красителем - 0,13-нымкумасси голубым Ц -250.Полосы, соответствующие субфрак- .1 О циям гистона Н, и Н 1 , вырезаюти помещают в 13-ный додецилсульфатнатрия, Инкубацию полос проводят.в течение 24 ч при 37 С. Затемизмеряют поглощение проб с элюиро вавшей краской при=590 на спектрофотометре.Краситель пропорционально связывается с гистонами поэтому посоотношению концентрации краски, 20 элюировавшей из полос, содержащихсубфракцни Н 11 и Н, можно судитьо соотношении концентрации белковв этих субфракциях.К зрелым сперматозоидам относят 25 те, у которых соотношение Н 1,/Н 1составляет 3:1. Использование для осуществления способа 0,4 и. НС 0 обеспечивает более полную экстракцию гистонов из ядер и является оптимальной концентрацией кислоты,Для получения чистых ядер проводят трехкратную отмывку в буферномрастворе, поскольку при двухкратЗ 5 ной отмывке в них еще присутствуют загрязняющие факторы, напримерлипиды.Четырехкратная промывка толькоусложняет способ и не дает улуч шения качества ядер.Для упрощения способа и возможности применения его в промышленныхмасштабах в качестве растворителяиспользован нетоксический детер гент - додецилсульфат. натрия.Измерение количества краски попоглощению при длине волны 590 ммкобусловлено тем, что при этой дли-не волны находится максимум погло щения использованного красителя -кумасси голубого 11-250.Количество же и набор реагентоввыбраны исходя из требований нормального протекания всех процес. сов, а также потому, что при отмыв.ке ядер необходимо использоватьдесятикратный объем буфера по отношению к объему ядер.3П р и м е р 1, Исследовали сперматозоиды белого амура, которые получали у половозрелых самцов в период нереста при индуцирований созревания спермы гормональными инъекциями. Сперму отбирали после инъекции и фиксировали в этиловом спирте, после. чего проводили выделение ядер, для чего сперматозоиды гомогенизировали в буферном растворе, содержащем 0,25 М сахарозы, 10 мМ трис-НС 8, рН 7,5, 1 О мМ МрС 1 , 25 мМ КС 1 и 25 мМ Жа 8 О . Гомогенат центрифугировали при 3000 д 5 мин, осадок обрабатывали 0,5 Х-ным тритоном Хв буферном растворе и затем отмывали от тритона Хтрехкратной промывкой ядер в буферном растворе, Затем ядра заливали 0,4 н. НС 2 и экстрагировали гистоны в течение 4 ч при 4 С. Послеоцентрифугирования при 3000 д супернатант заливали трихлоруксусной кислотой до конечной концентрации 187, Гистоны осаждали в течение 24 ч при 4 С, затем осадокособирали центрифугированием, промывали один раз подкисленным (0,25 н. НС 1) ацетоном и трнжды - чистым ацетоном, после чего гистоны высушивали под вакуумом.Злектрофорез проводили в 157-ном полнакриламидном геле, содержащем 0,1 Х додецилсульфата натрия. Гели окрашивали красителем ;0,1 Х-ным кумасси голубым-250 электрофореграмма, г)Полосы, соответствующие субфракциям гистона Н и Н , вырезали и помещали в 17-ный додецилсульфат натрия. Инкубацню проводили в течение 24 ч при 37 С. Затем измеряли поглощение проб с элюировавшей краской при 9=590. Краситель пропорционально связываетсяс гистонами, поэтому по отношению концентрации краски, элюировавшей нз полос, содержащих субфракции Н 1 и Н 1, судят о соотношении концентрации белков в этих субфракциях.В данном случае соотношение Н 1,/Н 1 равно 3;1, и сперматозоиды были отнесены к зрелым.Ниже приведено соотношение субфракций Н 1/Нв сперматогенных тканях белого амураСперматозоиды 3:1Зрелые семенники 2:1 1200869 4Незрелые семенники 1,4:1Печень 1:2При проверке полученной после 1инъекции пробы спермы по известнойметодике было установлено, что онасодержит большое количество зрелыхФсперматозоидов с нормальной подвижностью - бб с.П р и м е р 2, Аналогично примеруОисследуют пробу спермы, полученную после 11 инъекции гормоном, стимулирующим созревание.После исследования соотношениясубфракцни гнстонов Н 1 /Н 1 установ лено, что оно соответствует 2:1(электрофореграмма, О).Такие сперматозоиды относятсяк незрелым, хотя они и полученыиз зрелых семенников.2 О Исследования по общепринятойметодике подтвердили, что в этойпробе было увеличенное количество незрелых сперматозоидов с подЪвижнастью 45 с. В пробе преоблада ли не зрелые сперматозоиды, асперматиды, находящиеся на различных этапах созревания.П р и м е р 3. Аналогично примеруисследуют пробу спермы после ЗО 111 нныкции гормоном.Прн исследовании было установлено, что соотношение субфракцнйгистонов Н 1,/Н 1 составило 1,4:1(электрофореграмма,1).Исследования по общепринятой 35методике показали, что в пробесодержатся незрелые половые продукты с подвижностью 33 с. Кроме. того, для контроля были исследованы печень белого амура и гистоны тимуса теленка электрофореграмма, а, д).Значительное уменьшение соотношения Н 1/Н 1 В этих тканях посравнению с половыми клетками подтверждает вывод о связи данныхсубфракций со сперматогенезом укарповых рыб.Предлагаемый способ исключаетсубъективизм при определении степени зрелости половых продуктов самцов карповых рыб, поскольку он не зависит от погодных условий, как известный. способ определения степени зрелости по подвижности, а. также от опыта и физического состояния органов зрения наблюдате