Способ определения управляющих коэффициентов подсистем окисления и фосфорилирования системы окислительного синтеза атф

(5)5 С 12 0 1/ Я АВТОР ЕЛЬСТВ злучении и чиг ляции окислительно 00 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Горьковский медицинский институт им. С.М.Кирова(56) И/езтегЬоНета. Оп йе ог 9 п о 1 йе т 1 еб согнго о 1 Гптосйопбга гезрГатоп Ьу сне абеппе пасео 1 бетгапзосасог, -Агсй Восйегл Вормуз 1987,ч, 257. М 1, р, 154169.(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УПРАВЛЯЮЩИХ КОЭФФИЦИЕНТОВ ПОДСИСТЕМ ОКИСЛЕНИЯ И ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ СИСТЕМЫ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СИНТЕЗА АТФ(57) Изобретение относится к биохимии и к биофизике и может быть применено при Изобретение относится к биохимии и к биофизике, а именно к биоэнергетике.Цель изобретения - упрощение и повышение точности способа.Изобретение иллюстрируется следующими и римерами.П р и м е р 1, Сравнительное определение управляющих коэффициентов подсистем окисления и фосфорилирования графическим и аналитическим методами.Выделяют митохондрии из мозга крыс самцов общепринятым методом дифференциального центрифугирования, В холодной камере (О - 4 С) животных декапитируют, извлекают из черепной коробки полушария головного мозга и помещают их в стакан объемом 100 мл, заполненный охлажденной 1634718 А го фосфорилирования как энергетическими метаболитами, так и различными химическими и фармакологическими агентами, Целью предлагаемого изобретения является упрощение, повышение точности и расширение диапазона применения способа определения управляющих коэффициентов подсистем окисления и фосфорилирования за счет использования инкубационных сред с различной буферной емкостью. На фоне фосфорилирующего дыхания митохондрий в инкубационную среду добавляют ингибитор олигомицин в концентрации, вызывающей полное ингибирование дыхания, затем добавляют разобщитель в последовательно повышающихся концентрациях, скорость разобщенного дыхания определяют для каждой концентрации разобщителя, затем определяют управляющие коэффициенты одсистем окисления и фосфорилированиналитически или графически. 2 табл.(О С) средой выделения следующего состава: сахароза - 250 мМ, трис 2,5 мМ, трис-НС 8,5 мМ, ЭДТА 1 мМ, рН 7,4. Затем полушария головного мозга очищают от мозговых оболочек и кровеносных сосудов, промывают и гомсгенизируют с помощью тефлонового пестика со скоростью 200 об/мин, произведя 10 движений пестиком вниз- вверх. Гомогенат разводят до соотношения 1:10 и центрифугируют 10 мин при 1000 9. После этого надосадочную жидкость осторожно сливают в стакан, разливают по пробиркам и центрифугируют в течение 10 мин при 13000 9.Потребление кислорода измеряют поля рографически с помощью открытого платинового электрода, Применяют инкуба 1634718и Х Ы --- Х а Х а -Чз Чз Ч Чи Хр 2 - (Хр) Сок где чз - скорость фосфорилирук,щего дыхания;Чр - скорость разобщенного дыхания; р - концентрация разобщителя;и - общее количество добавок разобщителя в процессе эксперимента;Сок - управляющий коэффициент подсистемы окисления;Сф - управляющий коэффициент подсистемы фосфорилирования.Результаты определений приведены в табл, 1 и 2,П р и м е р 2, Изучение влияния ротенона на управлящие коэффициенты подсистем окисления и фосфорилирования, Исследуют влияние ротенона (специфического ингибитора НАДН-дегидрогеназы) на величины управляющих коэффициентов подсистемы окисления и фосфорилирования. Процедуры выделения митохондрий из мозга крыс самцов, а также измерения потребления кислорода митохондриальционную среду следующего состава: сахароза 250 мМ, КС 15 мМ, трис 10 мМ, КН 2 Р 04 20 мМ, ЭДТА 0,5 мМ, рН 1,4, В качестве субстрата дыхания используют 15 мМ глутамат. После прекращения дрейфа электрода в полярографическую ячейку добавляют суспензию митохондрий объемом 0,04 мл до конечной концентрации белка в ячейке 0,8- 1,2 мг/мл, Через 1 мин после добавки митохондрий в полярографическую ячейку с помощью полуавтоматической микропипетки вносят 0,02 мл 100 мМ раствора АДФ. Автоматически записывают динамику изменения концентрации кислорода в ячейке, Убедившить, что зависимость изменения концентрации кислорода от времени линейна, через 1 мин после внесения АДФ с помощью микрошприца в ячейку вносят ингибитор АТФ-синтетазы олигомицин до конечной концентрации в ячейке 200 нгlмл, вызывающей полное ингибирование фосфорилирующего дыхания. После прекращения дыхания добавляют протонофорный разобщитель 2,4-ДНФ последовательно до конечных концентраций в ячейке 5; 10; 20;40; 80 мкм. Управляющие коэффициенты окисления и фосфорилирования определяют по графику зависимости величиныЧзр- от концентрации раэобщителя р и аналитическим методом по фомуле С 4 ъ = 1 Сок, а5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ной суспензией те же, что и е примере 1. В качестве субстрата дыхания используют 15 мМ глутамат+ 5 мМ малат. Как и в случае примера 1, определяют скорость фосфорилирующего дыхания в присутствии избытка АДФ (2 мМ), затем добавляют ингибитор олигомицин е концентрации, вызывающей полное ингибирование фосфорилирующего дыхания, затем добавляют 2,4-ДНФ в последовательно повышающихся концентрациях 5; 10; 20; 40; 80 мкм и определяют скорость дыхания при каждой концентрации разобщителя.Составляют график, по оси ординат которого откладывают численное значениечзвыражения р - а по оси абсцис-конценЧтрацию раэобщителя р и определяют управляющий коэффициент подсистемы окисления как тангенс угла наклона экспериментальной прямой. Управляющий коэффициент подсистемы фосфорилирования определяют по формулеСф = 1 - СокРотенон применяют в концентрации 35 нМ, вызывающей подавление скорости фосфорилирующего дыхания на 60.Тангенс угла наклона экспериментальной прямой в присутствии ротенона равен 0,91, а в отсутствии его 0,68, Следовательно, под влиянием ротенона управляющий коэффициент подсистемы окисления повышается с 0,68 до,091. Следовательно управляющий коэффициент подсистемы фосфорилирования снижается с 0,32 до 0,09. Таким образом, ротенон, ингибируя скорость фосфорилирующего дыхания на уровне подсистемы окисления, увеличивает ее управляющий коэффициент.Формула изобретения Способ определения управляющих коэффициентов подсистем окисления и фосфорилирования системы окислительного синтеза АТФ, включающий определение скорости фосфорилирующего дыхания в присутствии высоких концентраций АДФ, добавление протонофорного разобщителя и определение скорости разобщенного дыхания, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения и повышения точности способа, до добавления разобщителя е инкубационную среду вводят ингибитор олигомицин е концентрации, вызывающей полное ингибирование фосфорилирующего дыхания, разобщитель добавляют в последовательно повышающейся концентрации, скорость разобщенного дыхания определяют для каждой концентрации разобщителя и затем рассчитывают управляющие коэффициентыказ 733 Тираж 365 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 л.Гагарина, 10 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужго подсистемы окисления Сок и фосфорилирования Сф по формулам где и - общее количество добавок разобщителя в процессе эксперимента;р - концентрация разобщителя; чз - скорость фосфорилирующего дыхания;Чр - скорость разобщенного дыхания,или по графику зависимости величины 5 Чзр - от концентрации раэобщителя р,Чргде управляющий коэффициент подсистемы окисления определяется как тангенс угла наклона экспериме.таль ной прямой.