Способ получения моноспецифических антисывороток

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН 1)5 А б 285 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТА ВТОРСКОМУ СВИДЕГЕЛЬСТВУ ИЯ 2фективной иммунизации людей и животных, а также для получения высокоактивных моноспецифическнх сывороток,Цель изобретения - повьппение активности целевого продукта с одновременным снижением количества актигека;используемого для иммунизации, Дляэтого мокоспепифические актисывороткиполучают комбинированной иммунизациейживотных-продуцентов индивидуальнымибелками - актигеками, выделеннымиэлектрофоретически, сначала в растворе в смеси садьювактом Фрейкда, азатем - в составе измельченного полиакриламидкого геля, Способ позволяетполучать высокотитражкые актисыворотки, исходя иэ 50 мкг индивидуального белка-актигека,чно-иссл кулярной гукие мии зации.Это достигается ко иммунизацией животных раствором белка-антиг адъювантом Фрейнда, а таве измельченного пол бикированнойпродуцентовка в смеси с и моноспециФичесндивидуальным сосзат но иакрил состав слочают в себ геля, что позволяет получать высокотитражкые актисыворотки, исходя из очень малых количеств актигека,Способ осуцествляют следующим образом.Сложную смесь белков подвергают электрофоретическому разделению в полиакриламидком геле в присутствии 0,1%-ного ЦЦС-а. После окончания электрофореза для удаления 1 ДС-Иа гель выдерживают в 20 объемах 50%ноых смесеи, симыхэтапа ью определ х процеду ив иду альнь выделеннь ных белко два незав На первоного наб е с пом т исслеИа вто- антир выдел й бело гм белко охимическдуемый икдром этапегеном иммцентов.Целью ия является повыелевого продукта, нижением количества обретености кение а с:однов ным. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР/(71 Всесоюзный науедовательский институт моле биологии Минмедбиопрома(56) Редегвеп С.Е ЕгЫу З.А БерагаНоп, ьво 1 аюп апд ищпцпо 1 оуса 1 вгпй 1 ев о 2 СЬе вггисгпга 1 ргосе 1 пв оГ чепезие 1 ап Еупе епсерЬа 1 ощуе 11" СЫ чдвцв, - 71 го 1., 1974, ч. 14, п. 4, 740-744.(54) СПОСОБ ПОИУЧЕИЯ ИОИОСПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИСЪВОРОТОК(57) Изобретение относится к молеку-, лярной биологии, иммунохимии, медицине и может быть использовано для эфИзобретение относится к меди биологии, а именно к иммунохмолекулярной биологии идиагноинфекций,Способы полученияких антисывороток к иполипептидам входящим в низируют животных-проду тена, используемого дл1587724 3о (об/об) водного раствора этанола,рокрашивают в О, 1 Х-ной водной суспензии Кумасси ярко-синего Киотмывают Фон 10/-ным (об/об) воднымрастворомэтанола. Окрашенную зонуИсследуемого белка вырезают, гельИзмельчают н отмывают от связанного сбелком красителя 50 Х-ным водным растором этанола, Элюацию белка из геляроводят свободной диффузией в буфее, содержащем 2 Х ДДС-Ма и 5 Х р-мераптоэтанола, в течение 48 ч. Послеэтого частички геля и водную фазуазделяют и диализуют по отдельностипротив Физиологического раствора,1/2 часть элюата смешивают с равнымобъемом полного адъюнанта фрейнда ивводят подкожно кроликам. Через14 дн кроликов повторно иммунизйру,ют подкожно оставшейся частью элюатав смеси с неполным адъювантом Фрейнда, Через 14 дн. после второй иммунизации кроликам вводят подкожно измельченный полиакрилаиидный гель с 25оставшимся в нем некоторым количеством белка-антигена, Через неделю после третьей иммунизации у животныхберут кровь, иэ которой стандартныиспособом получают иммунную сыворотку. 30П р и м е р, Получение моноспециФических антисывороток к структурным белкам оболочки вируса осповакцины,2 иг вируса оспонакцины (ВОВ) ресуспендиронали н 1 ил буфера (0,01 Мтрис-НС 1, рН 9,0, 0,5 Х ИР), инкуобировали 30 мин при 37 С и центрифугировали 30 иин при 30000 В, Супернатант обозначили, как МР-фракцию.Аналогично получали 2-меркаптоэтанолФракцию обработкой вируса 0,02 М 2 иеркаптозтанолои. Оеадок представляетсобой сердцевину ВОВ. Электрофореэпроводили в 15 Х-ном полиакрилаиидномгеле в прерывистой буферной системев присутствии О, 1 Х ,ДС-Ма.К фракциям МРи 2-меркаптоэтанол добавили ДДС-Иа до 2/ и 2-иеркаптоэтанол до 5 Х и прогрели в течение2 мин на кипящей водяной бане. Электрофорез белков проводили в двух пластинах 15/-ного полиакриламидного геля(с соотношением мономерон 1 ОО;1),размером 120 х 100 х 1,5 мм в прерывистойбуферной системе Лэммли, при напряжении 10 ОВ и течение 6 ч,3После окончания злектрофореза пластины гелей вымачивали 2 ч в 0,5 л 50 Х-ного водного раствора этанола дляудаления ДДС-Ма и переносили в 0,5 л1 Х-ной водной суспензии. Кумасси ярко-синего Кна 1 ч,фоновое окрашинание отмывали в двух сменах по0,5 л 10 Х-ного водного раствора этанола в течение 2 ч при постоянном покачивании.Окрашенные эоны белков р 35 в случае ИРфракции, р 35 и р 67 н случае 2-меркаптоэтанол-фракции вырезали из геля и тщательно измельчали вфарфоровой ступке. К образцам измель.,ченного геля добавляли по 30 мл50 Х-ного водного раствора этанола,инкубировали смесь н течение 1 О минс перемешиванием для удаления из геля красителя. Частички осаждали центрифугированием взвеси при 10 000 е .втечение 10 иин при комнатной температуре. К осадкам измельченного гелядобанляли по 3 объема элюирующего буФера (2/ К 1 С-На, 5/ 2-меркаптоэтанола, 0,01 М трис-НС 1, рН 9,0), прогревали взвесь н течение 3 мин при 100 Си инкубиронали 48 ч при постоянномперемешивании на качалке при коинатной температуре,После этого частичкам геля давалисвободно осесть в течение 1 ч, надосадочную жидкость собирали и диализовали против трех смен пол физиологического раствора в течение 24 ч сначала при 200(", а затем - при 4 С.Полонину отдиализованного препарата, содержащего элюированный из гелябелок, смешивали с равным объемом полного адъюнанта фрейнда до образонанияоднородной эмульсии и вводили кроликам подкожно в область лопаток, Через14 дн. вторую половину элюата смешивали с равным объемом неполного адъю",нанта фрейнда и повторно подкожно иимунизировали кроликов. Через 7 дн.после второй иммунизации у кроликовзабирали кровь иэ краевой ушной веныи стандартным способом получали изнее сыворотку.Измельченный полиакриламидный гельс оставшейся н неи после элюации частью белков диализовали против трехсмен по 1 л буфера (0,01 М трис-НС 1,рН 9,0) в течение 48 ч сначала при20 С, а затем - при 4 С, смешивалиего после этого с равным объемом того же буфера н через 14 дн, посленторой иммунизации вводили его кроликам подкожно н область лопаток, Через30 5 15877 дн, после третьей иммуниэацйи у животных забирали кровь и получали иэнее сыворотку,Активность иммунных сывороток(антисывороток) оценивали методомраДИоиммуноанализа с 1 Я-меченымбелком А иэ Зй,ацгеце на твердом носителе (полистирольные планшеты), Вкачестве контроля использовали нормальные сыворотки, полученные ст соответствуничих животных эа 5 дн, допервой иммунизации. Титром антисыворотки считали максимальное ее разведение, при котором в реакции радиоиммуноанализа наблюдалось еще 2-3-кратное превышение уровня включения Драдиоактивности над уровнем включенияконтрольной (неиммунной) сыворотки,Сыворотки, полученные от живот" Жных после второй иммунизации тольков случае белка р 35 из МР-фракции,показывали достоверное превышение.над Фоном в реакции радиоиммуноандлиэа в разведении 1/50, 25После третьей иммунизации белкамив составе измельченного полиакриламидного геля титр всех трех днтисывороток резко возрос и составил1(1000-1) 10000, что соответствуеттитру 1(128-1)256 в реакции радиальной иммунодиффузии,Специфичность антисывороток проверяли методом радиоиммуноблотинга, ис"пользуя суммарные вирусные белки,разделенные электрофоретически н35, 15%-ном полиакриламидном геле, с последующиМ переносом их на нитроцеллюпозный Фильтр и выявлением комплексон антиген-антитело 1 Л -меченымгм40белком А из БС,аогеиэ авторадиограФией.Для получения моноспецифическихантисывороток по предлагаемому спосо.бу.потребовалось по 20, 70 мкг каждого из индивидуальных белков,Для получения же моноспецифических антисывороток описанными в лите ратуре способами требуется более0,5 кг белка-антигена, при этом активность получаемых антисыворотокзначительно ниже активности антисывороток, полученных предлагаемым способомПоложительный эФФект предлагаемого способа по сравнению с прототипомзаключается в сиижении дозы антигена, необхоДимого для иммунизации,более чем в 1 О раэ при однонременном увеличении титра антител в целеном про;.;чкте.Технико-экономические преимущест ва предлагаемого способа заключаются в значительном сокращении объема работ по получению целевого продух" та, поскольку для накопления необходимого для иммунизации количества белка-антигенд, во-первьм, требуется н 10-20 раз меньше исходного препарата белков, во-вторых, достаточно проведения одного цикла препаративного электрофореэдПредлагаемый способ может быть рекомендован для стносительно быстрого, простого и эффективного получения моноспецифических антисывороток высоким титром против индивидуальных белков-антигенов, входящих в состав слож ньм смесей, при их общем содержании 0,03-0,06 мг.формула изобретения Способ получения моноспецифических антисывороток путем электрофоретического вьпеления днтпгена н", общей массы белков в виде полоски голиакриламндного геля, измельчения, иммунизари. животных посредством мно- гокрдтногс введения им порций размельченного геля, содержацих днтиг.н и адъювднт Фрейпда, с последующим забором крови у иммунизированных животных, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, с одновременным снижением количества днтигенд, исполь-, зуемого для иммунизации, после измельчения полоски геля обрдбатывают вначале водным раствором этднолд, затем - трис-НС 1 буферным раствором, рН 9,0, содержащим додецилсульфат натрия, 2-меркдптоэтанол, инкубируюто вначале н течение 3 мин при 100 С и затем - в течение ч 8 ч при комнатной температуре, суспензию р, зделяют на элюат, осадок рдзмсльцеппого геля и каждую часть диализуют против физиологического раствора, а иммунизацию животньм осуществляют комбиниронанно путем двукратного введения км элюата в смеси с адъювантом Фрейнда и одиократного введения осадка беэ адъюнанта,