Способ определения метаболитов в биологическом материале

СОЮЗ СОВЕТСНИХСООИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН 19) Я 51 сО О И 33/50 АВТОРСН адомская й инсти у апа А -КеСопкуйо 3.оу 969 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(7) Куйбышевский медицинсктут им Д.И.Ульянова(54)(57:) СПОСОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИЕТЬВОЛИТОВ В БИОЛОГИЧЕСКОИ МАТЕРИАЛЕ путем фиксации ткани, осаждения белка хлорной кислотой и спектрофотометрирования при 340 нм в присутствии никотинамидного кофермента и ферментов лактатдегидрогеназы при определении пирувата и глутаматдегидрогеназы при определении сА "кетоглутарата, о т " л и ч а ю щ и й с я тем, что с целью дополнительного определения в одной пробе малата, лактата, д, -глицерофосфата,-оксибутирата, глута" мата, оксалоацетата, ацетоацетата, к диоксиацетонфосфата, вносят часть нейтрализованного экстракта в глицннгидразиновый буфер рН 9,5, содержащий 4,5 10 К окисленный никотинамидадениндинуклеотид и определяет малат, лактат, А -глицерофосфат,глутамат и-оксибутират при последовательном добавлении соответственно малатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы, Ж -глицерофосфатдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназы и-оксибутиратдегидрогеназы, а другую часть нейтрализованного экстракта вносят в триэтаноламинсолянокислый буФеррН 7,6, содержащий 1,44 О И восстановленный никотинамидадениндинуклео- Юф тнд, и определяют пируват, оксалоацетат, д- -кетоглутарат, диоксиаце" тонфосфат и ацетоацетат при последовательном добавлении соответственно лактатдегидрогеназы малатдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназы, д- -гли" церофосфатдегидрогенаэы и Д -оксибутиратдегидрогеназы.Изобретение относится к биологии и может быть использовано в медицине для определения содержания метаболитов в биопсийном материале тканей при оперативных вмешательствах, а 5 такыре в условиях эксперимента на животных для характеристики специфики обмена каждой ткани в норме в качест" ве диагностических и прогностических тестов при патологических состояниях,10Цель изобретения - дополнительное определение. н одной пробе малата, лактата, А -глицерофосфата,-оксибутирата, глутамата, оксалоацетата, ацетоацетата и диоксиацетонфосфата, 15П р и м е р. Биопсийный материал (например, печень) после взятия эали" вают жидким азотом, нанеску в 200 иг гоиогенизируют до получения однородной порошкообраэной массы, подливая 20 жидкий азот. Порошок запивают 0,4 мл 0,6 н. раствора НС 0,1, тщательно растирают при комнатной температуре и оставляют для экстракции на 20 мин. По истечении времени центрифугируют 25 при 600 д 15 мин. Кислый супернатант сливают, осадок денатуриэованного бел - ка отбрасывают. По универсальному индикатору нейтрализуют 2 и, КОН 0,6 ил. Помещают в ледяную баню на 5 иин и центрифугируют при 600 д 5 мин для освобождения от гппахлорида калия,Определение содержания малата,лактата, А -глицерофосфата,глутамата З 5и-оксибутирата.Состав реакционной смеси;Буфер глицннгпдраэинсульфатный,рН 9,5,глицин 0,5 М, 40гидраэин-сульфат0,4 И, мл 2 У 8НАД 0.,9 мг/мл, мл О,Нейтрализованныйэкстракт, ил 01 45Фермент, мкг 10Общий объем смеси 3 мл.Длина волны 340 нм, слепой опытне содержит кофермента, Реакция начинается последовательным внесением 50фермента малатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы, сА "глицерофосфатдегидрогеназы, глутаматдегидрогенаэы, и" "оксибутиратдегидрогеназы. Учитывается прирост оптической плотности 55с момента ннесения соответствующегоФермента до прекращения прироста истабилизации показателей: Е - Е, со-, тяии;К - коэффициент раэнедения;3 - объем реакционной сиеси;6,22 - коэффициент микромолярнойэкстинции НАД. Н при 340 нмсм lмкмоль),Приведенная Формула является однотипной рпя расчета содержания определяемых метаболитов и коферментов в микромолях на 1 г ткани.Определение мапата.Вносят малатдегидрогенаэуЕ 0,06701000235 Е, 0,1йЕг 0,0С = 0,545Определение лактата.Вносят лактатдегидрогенаэуЕо 0,150,1450,1700,1950,2600,3000,3200,3400,3700.415Е 0,415Е = 0,300 йС = 4,38.Определение с -глицерофосфата.Вносят 1 -глицерофосфатдегидрогенаэуЕо 0,320 0,340 0,352 0,370 0,375 О, 382 0,385 0,385 0,065 ЕЛЕ=С = 1,013Определение глутамата.Вносят глутаматдегидрогеназуЕо 0,3950.415 ответствует содержанию малата в пробе; Е-Е, лактата; Е, -Е,с -глицерофосфата; Е - Е; " глутамата; Е-Е, й -оксибутирата, Концентрация метабометов выражается в микромолях наг ткани, Расчет ведут по формулеЬЕ 36,22 Кгде Д Е - разница между конечной и начальной оптическими плотнос1157459 0,430 0,455 0,460 0,470 0,475 0,475 0,080 0,485 0,500 0,510 0,525 0,540 0,550 0,555 0,560 0,560 0,065 0,210 0,645 0,640 0,635 0,630 0,625 0,625 0,020 Е 5ЬЕ=С 0,184,ВНИИПИ Заказ 3361/43 Тираж 897 Подписное Филиал ЛПП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная, 4. ЕДЕС 1,25Определение Р -оксибутирата.Вносят"оксибутиратдегидрогена 16эуМЕо Е 5 20ДЕС = 1,013Определение пирувата, оксалоацетата, А -кетоглутарата, . диоксиацетонфосфата и ацетоацетата,25Состав реакционной смеси;Буфер триэтаноламинсолянокислый 0,1 И,рН 7,5, мл 2,7НАДН 3 мг/мп, мл 0,1 ЗОНейтрализованныйэкстракт., млФермент, мкгОбщий объем смеси 3 мл.Определение ведется при длине вол-З 5ны 340 нм, слепой опыт не содержиткофермента. Реакцию начинают внесением фермента для определения пирувата лактатдегидрогенаэы. Регистрируется Ео . Реакция учитывается до стабилиэации показателя оптической плотности в течение 3-5 мин, (Е ). После"довательным внесением малатдегидрогенаэы, глутаматдегидрогеназы,ц -гли.церофосфатдегидрогенаэы и-оксибутиратдегидрогенаэы регистрируетсяуменьшение оптической ппотности (Е,Е, Е и Е ) Ь Е соответствует содержанию в пробе оксалоацетата,о -кето глутарата, диоксиацетонфосфата,ацетабацетата. Определение пирувата.Вносят лактатдегидрогенаэу Ео 0,7400,735 0,730 0,723 0,718 0,712 Е 0,712 Е= 0,028 АС0,409,Определение оксалоацетата.Вносят малатдел 1 дрогеназуЕа 0,7150,7000,695Оэ 690 Ер 0,690 ДЕ= 0,025 С " 0,366 Определение о -кетоглутарата. Вносят глутаматдегидрогеназу Ео 0,695 0,680 0,672 0,650 0,650 0,645 Е 5 0,645 Е= 0,040