Штамм -82-продуцент холестериноксидазы

(54) (57) ШТАИИМЕ ИНИН А 8 микроорганизмфизиологии миколлекционныйПРОДУЦЕНТ ХОЛЕ 77/28.83 7 ЕЮ 011 ллекцияимии иСССР,БТКЕРТОИУСЕЗ ЬА ( Всесоюзная ко в Института биох роорганизмов АН номер А - 840 Д СТЕРИНОКСИДАЗЫ. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ АВТОРСКОМУ СВИЛ1125250 Изобретение относитеся к микробиологическому синтезу ферментов иможет быть применено для полученияхолестериноксидазы.Известен продуцент холестериноксидазы ЯйгерСошусез 1 ачепйп 1 аеВКИ-А, который при культивировании на среде, содержащей глюкозу,аспарагин, дрожжевой экстракт ихолестерин в качестве индуктора, в 1 Оаэробных условиях образует до2 г/л биомассы с активностью 3045 ед/г 11 .Недостатком этого продуцента является невысокая холестериноксидазнаяактивность, а также то, что прикультивировании.на жидких средахЯ 1 г 1 ачепйп 1 ае ЗКИ-А 591.образуетпигменты меланоидного типа, затрудняющие получение и очистку фермент- щного препарата.Наиболее близкими к изобретениюпо технической сущности и достигаемому положительному эффекту являютсяпродуценты холестериноксидазы Я 1 г, 2ЬуВтозсор 1.сиа, а также Яег. ягзео"Епаспз и Яйг. асЫошусез.сиз. Прикультивировании на,среде сложногосос-.ва содержащей дорогостоящиекомпоненты, такие как пептон, крахмал и.дрожжевой экстракт, в течениедлительного срока(3-4 сут) в клеткахактиномицетов содержится 106,284,6 ед/г холестериноксидазы 121.Недостатком цветных продуцентовявляется то, что выращивание прово 35дят в течение длительного срока намногокомпонентной дорогостоящейсреде,Целью изобретения является штамм -40продуцент холестериноксидазы, обладающий высокой активностью при выращивании на среде простого состава втечение 1-2 сут и не образующийпигментов при культивировании наприменяемых средах.1Полученный штамм Яйгерошусез1 ачепйи 1 ае ИНИИ- А 8- 2 коллекцияинститута биохимии и физиологиимикроорганизмов, коллекционный номерВКИ АД), являюшийся высокоактивным продуцентом холестериноксидазы, обладает следующими признаками. Культурально"морфологическиепризнаки штамма. На,агаризованнойсреде СРКрасильникова колонии7-1 О-ти суточного возраста белогоцвета, гладкие, плоские, с ровными краями, диаметром 8-10 мм, пигментане образует.На среде Гаузеколонии розоватолилового цветацвет лаванды), гладкие или складчатые, диаметром до8 мм, субстратный мицелий пепельносерого цвета, пигемента не образует.На картофельном агаре рост в видекрупных 10 мм)колонии белого илислегка розоватого цвета, воздушныймицелий хорошо развит, белого цвета,субстратный мицелий бурого цвета,пигмент не образует.На.МПА растет плохо, воздушныймицелий не образует, колонии светложелтого цвета, 5-7 мм в диаметре,пигмент не образует.ФНа сусло-агаре колонии розоватолилового цвета с хорошо развитымвоздушным мицелием, 8-10 мм вдиаметре, субстратный мицелий темносерого цвета,Физиологические признаки, Желатину разжижает, молоко коагулирует ипептонизирует, Сероводород и индолне образует. Нитраты не восстанавливает. В качестве источника углеродапотребляет глюкозу, фруктозу,маннит и ксилозу. Не потребляет саха.розу, рамнозу и инозит. На ломтикахкартофеля растет обильно в видесерого налета.Оптимальная температура роста28-30 С. При 37 С рост слабый, при45 С - не растет.оОбладает антибиотической актив -ностью против граммоположительныхи граммотрицательных бактерий.Штамм выделен из популяцииколлекционного штамма ЯСгерошусезауепдп 1 ае К 4004.При культивировании на жидкойпитательной среде определенногосостава образует холестериноксидазу,активность которой составляет 170,5 -380, 5 ед. на грамм сухой биомассы.Сравнение преимуществ предлагаемого штамма с известными продуцентами приведено в таблице.П р и м е р 1. В качестве исходного посевного материала используюткультуру, выращенную на скошенномагаре в течение 10 сут и хранящуюсяв холодильнике при 5 фС. Применяютсреду следующего состава г/л: глюко 5 за 20,0; ЮНЮ 32,0; СаС 01,0; белково-витаминный концентрат 3,0; водаводопроводная с рН 7,2. Среду разливают в широкие пробирки по 7 мл иором герГошус ыеоЕовс 141,8-223 3 е влияет ггерош 126,0-252 3говорсо 142,3-284,6 влия ЗГгерсотусевас Ыошусег,1 со 168,1-216,3 106, 6-213, 2 71,1-4 Бггергошусеачепйо 1 аеВКМ-А 591 0; 0-.45,5-.4,0,5-38 е влияет каз 8435/18 Тираж .5 исио г.Ужгород оектная,3 1125 колбы Эрлнмейера на 250 мл ло 70 мл. Смывом со скошенного агара засевают среду в пробирках 0,2 мл на 7 мл сре. дь, Выращивание проводят на качалке с 240 об/мин в течение 48 ч при5 28 С: Полученной жидкой культурой засевают среду в колбах(7 мл культуры на 70 мл среды). Выращивание проводят на качалке с 190 об/мин в течение 22 ч при 28 С, 0Биомассу отделяют на центрифуге при 5000 об/мин и промывают 1/15 М фосфатным буфером. Холестериноксидазную активность определяют по опи- санной методике. За единицу холестериноксидазной активности принимают количество микромоль холестеиона, образующегося под. действием холесте риноксидазы из холестерина за 1 мин при 37 С. ЮАктивность биомассы составляет 380,5 ед. на 1 г.П р и.м е р 2. Штамм Яйг,1 ачепйо" 1 ае ВКМ - А 840 выращивают в ферментере емкостью 100 л, Объем среды 28 л. Состав среды г/л: глюкоза 28,0; ИНИ 02,01 СаСО 2,0; белково-витамин" ный концентрат 3,0, рН 6,9. Среду ясгергошусев 1 ачепй 1 ае ВКМ А предлагаемый штамми 250 4в Ферментере засевают 48-ми часовой жидкой культурой, выращенной на среде того же состава в колбах на 3 л. Объем посевного материала на ферментер 2,0 л. Выращивание прово.дят 22 ч. Биомассу отделяют сепарированием, дважды, промывают дистиллированной водой. Получают 3,0 г/л биомассы с холестериноксидазной активностью 364,0 ед. на 1 г.Холестериноксидаза, полученная из биомассы предлагаемого штамма, может найти применение как реагент для клинических анализов при количественном определении холестерина, а также может представить интерес как средство для снижения уровня холестерина в крови. Высокая холестериноксидазная активность продуцента и отсутствие пигмента в биомассе и культуральной жидкости позволяет значительно повысить выход фермента и упрощает процесс очистки фермент- ного препарата.На опытной установке ИНМИ АН СССР получены партии ферментного препара" та холестериноксидазы, которые были очищены в 5-7 раз.