Способ определения активности препаратов вирусов ядерного полиэдроза и гранулеза

(19) (11 Я 7 ЗОБ РЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ОПИСАНИЕ И АВТОРСКОМУ СВИДЕ(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биологическихметодов защиты растений и Всесоюзный научно-исследовательский институт микробиологических средствзащиты растений и бактериальныхпрепаратов(56) 1. Зариньш И., Путнаэрглис ЭОценка способов определения концентрации вирусных препаратов,Труды ЛСХА, вып.164, 1978, с.47-552, Тарасевич Л.М. и др. О смешанной вирусной инфекции у озимойсовкиСб. Микроорганизмы и вирусыКишинев, "Штиинца", 1979.(54) (57) 1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ ВИРУСОВ ЯДЕРНОГО ПОЛИЭДРОЗА И ГРАНУЛЕЗА, предус- матривающий электронное микроскопирование супервириокапсидов, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности и достоверности способа, из супервириокапсидов готовят ульратонкие срезы, при микроскопировании которых подсчитывают количество нуклеокапсидов и по количеству последних судят об активности препарата.2.Способ по п.1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что перед приготовлением среза супервириокапсиды фиксируют, обезвозживают, заключают в эпоксидную смолу, а перед микроскопированием среза производят их контра стирование.Изобретение относигся к защитерастений, а именно к определению качества энтомопатогенных вирусных препаратов, применяемых н борьбе с вредными насекомыми сельскохозяйственныхкультур и лесных насаждений, и можетбыть использовано в производственных лабораториях, работающих с энтомо, патогенными вирусными препаратами.Известен способ определения ка"честна вирусных препаратов, включаю Ощий подсчет количества супервирионныхкапсидов (СПВК) - полиэдров, телвключенный в камере Горяева, предназначенной для подсчета элементовкрови 1 1) 15Наи более бли з ким к предлаг аемому является способ, предусматривающий электронное микроскопированиесупернириокапсидов. При этом подсчитывают супервириокапсиды н 1 млисходной суспензии по формуле:А.В.О.Х , где А - число супервирио,капсидон н поле зрения микроскопа;В - число полей зрения микроскопапри данном увеличении (оно определяется, отклонениемсеточки)поля зренияО - разведение суспензии; Х - коэффициент, показывающий во сколькораз 1 мл суспензии больше количества суспензии, нанесенной на сет уг.Согласно известным способам активность вирусного препарата определяется по количеству супернирионных капсидрв, которые не являютсянепосредственными носителями вирусной инфекции и, следовательно, способне является достаточно точным и достоверным, так как количество полиздров еще не обуславливает активности препарата,Цель изобретения - повышение точности и достоверности способа,Поставленная цель достигаетсятем,что согласно способу определения активности препаратон нирусонядерного полиэдроза н гранулеза,предусматривающему электронное микроскопирование супервириокапсидов, изсупервириокапсидов готовят ультратонкие срезы, при микроскопиронаниикоторых подсчитывают количество нуклеокапсидов и по количеству последних удят об активности препарата.Перед приготовлением среза супервириокапсиды фиксируют, обезвожинают,заключают в эпоксидную смолу, а передмикроскопированием среза производятих контрастиронание,П р и м е р. Опрелег.яли количества 60 нуклеокапсидов в вирусном препарате в процессе его хранения н холодильнике при +4 С, н течение 24 мес для чего брали 10 мл жидкого вирусного препарата ВПРИН-ЭКС, фиксировали его 65РН;йргде И - число нуклеокапсидон в одномСПВК;Р - средний диаметр СПВК;и - средняя протяженность ну клеокапсида вдоль высоты цилиндрав ,число нуклеокапсидон на однойплоскости среза через СПВК.В процессе хранения часть нуклеокапсидов разрушается и на их месте остаются электронно-прозрачные участки такой же формы и величины как и вирианы или поливирионы. После 12 мес хранения вирусного препарата ВИРИНЭКС при - 4 С сохраняются 70нуклео+ окапсидов (табл.1). Таблица 1 Количество обнаруженных нуклеокапсидов,.Время, мес 0 100,0 1 97,1 2 94,2 3 91,5 4 88,8 5 86,2 6 83,7Одновременно были поставлены биологические опыты в лабораторных и производственных условиях для оценки указанных препаратов на тест- насекомых, Качество препаратов, н частности инсектицидная актинность, определялось по стандартной методике и выражалось в летальной концентрации препаратов, вызывающей 50гибели тест-насекомого (ЛКО ) при свободном поглощении корма ( табл.),в 2-ном растворе глутарового альдегида 2,5 ч и в растворе осьмиевойкислоты 1,5 чпри комнатной температуре. Фиксированный материал промывали в какодилатном буфере три раза по15 мин и обезвоживали ацетоном н серии возрастающих концентраций от 30до 100 . Фиксированный и обезноженный материал заключали в эпок 812Проводили ультратонкие срезы с помощью ультрамикротома, которые контрастировали 15 мин 2 -ным ноднымраствором уранилацетата и 5 мин цитратом свинца по Рейнольдсу., В электронном микроскопе определяли диаметрультратонких срезов и количество нуклеокапсидов в них, Количества нуклеокапсидов в целом СПВК подсчитывали поформуле1116059 Таблица 2 По прототипу По предлагаемому способу Время,хране Количест-,во нуклеокапсидов Количествонуклеокапсидов Смертностьтестнасекомых, Ъ Количество Количест.во СПВК ния, мес СПВК 0 4 х 1051 х 10 50 1 х 155 5 х 10 бх 10 6 2 х 10 5 х 10 50 5 х 10 50 12 2 х 10 Цэодолжение табл. 2 По базовому способу Смертность тест-на секомыхЪ Времхранния,мес Количество Количество Смертность нуклеокапси довЗаказ 6865/28 Тираж 521 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д,4/5 Филиал ППП Патент,.г.ужгород, ул,Проектная,4 Как показывают данные табл.2,точность определения активности вирусного препарата по предлагаемомуспособу повышается за счет выявления 40непосредственных носителей вируснойинфекции - нуклеокапсидов, присутствующих в СПВК, Так, например, втитре полиэдров 1 х 104 содержатся4 х 10 нормальных йуклеокапсидов,обеспечивающих 50 Ъ гибели тестнасекомых,в то время как по прототипу эту же гибель обеспечиваеттитр 1 х 105 СНВК, а по базовому способу 1 х 10 а СПВК. По мере сниженияточности и достоверности способавозрастают определяемые величины требуемых титров СПВК для достижения50 Ъ гибели тест-насекомых. Следовательно, известные способы, недавая точного определения истинныхносителей инфекционного начала. -нуклеокапсидов, приводят к завышенным результатам определений по количеству СПВК и к неоправданному расходу препарата, необходимого для достижения поставленной цели.