Способ консервирования клеток -7

/ООПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ДЕТЕЛЬСТВУ К АВТОРСКОМУ огии во СССР 7.Микробио -450,логия1978 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОЧЙРЬ 330302/30-154,08.810.08.84. Бюл. В 32.А.Цуцаева, Л.Н.Лавровасеканцев, В.М.Маркова,кин, В.Л.Броншнейн,ерович и Г,А.Тренинанститут проблем криобилмедицины АН УССР78.68(088.8)(54) (57) СПОСОБ КОНСЕРВИРОВАНИЯ КЛЕТОК РПЯАВХЦМ МОМ 1 ЫРОВМЕ Р 8-7 путем замораживания в среде криопротектора, отличающийся тем, что, с целью повышения жизнеспособности клеток, замораживание производят со скоростью 1-2 С в мин от 15 б20 С до (-70) - (-90) С, а в качестве криопротектора используют 1-ЗЕ-ный раствор сахарозы, или 1-53-ный раствор диметилсульфоксида, или 1-37-ный раствор глицерина.1 11107Изобретение относится к микробиологии и может найти применение при производстве гиббереллина, используемого в качестве кормовой добавкив животноводстве. 5Известен способ низкотемпературного консервирования микроорганизмов с помощью защитной среды, содержащей 10-50% глицерина, 5-20% сахарозы и 10% буФера 11. 10Однако этот способ не обеспечива-, ет высокой жизнеспособности клеток Рцзагцш шоп 11 Еогше Ря, так как при наличии в защитной среде лимоннокислого натрия и при некотролируемой скорости охлаждения жизнеспособность клеток снижается.Известен способ низкотемпературного консервирования бактерий, заключающийся в том, что микробные сус О пензии замораживают до "19 б С со .ь скоростью 400 С/мин под защитой криопротекторов глицерина или полиэтиленоксида мол.в. 400 в концентрациях 5 - 10%2Однако известный способ не обеспечивает высокой жизнеспособности клеток Гцзагхцщ шоп 11 хйогше Рв. При консервировании под защитой ПЗОжизнеспособность клеток 1,2%,3 О под защитой глицерина 50%.Цель изобретения - повышение жизнеспособности клеток Гцзагхцш шоп 1 хКогше Рд.Указанная цель достигается тем, что клетки Гцзаг 1 цш щоп 11 Ыогще Ря 35 замораживают со скоростью 1-2 ьС/мин от 15-20 С до (-70) - (-90) С в среде криопротекторов 1-3%-ной сахарозы, или 1-37-ного глицерина, или 1-5%-ного диметилсульФоксида.Способ осуществляют следующим образом.Клетки Гцзаг 1 цщ щоп 111 гогше Р 8-7, отмытые от ростовой среды, ресуспендируют в 1-37-ном растворе глицерина, или в 1-5%-ном растворе ДМСО, или в 1-37.-ном растворе сахарозы. После 10-15-минутной экспозиции в защитной среде образец охлаждают от 15-20 С до (-70) - (-90) С со скоростью 1- 2 С/мин. Затем образец погружают в жидкий азот, Отогревают образец на водяной бане при 28-30 С.П р и м е р 1, Образцы клеток Гцзаг 1 цш шогй 11 Гогше Рвв объеме 1,5 мл, отмытые от ростовой среды (среды Чапека), ресуспендировали в 3%-ном водном растворе глицерина. Исходная концентрация жизнеспособных клеток в пробе составила (1,7 ++ 0,1425) 10 ф клеток/мл. После 15-минутной экспозиции в защитной средеобразец охлаждения от 20 до -90 ОСсо скоростью 1 С/мин. Затем образецпогрузили в жидкий азот. После хранения в жидком азоте в течение 2 летобразцы отогрели на водяной бане при28 С. Оценку качества клеток Гцзагцш шоп 11 Ыогше Ряпроводили по количеству жизнеспособных клеток в образцах, морфологической сохранностиклеток чашечным методом, Количествожизнеспособных клеток Гцзагдцш шопг 112 огше Рдпосле хранения в течение 2 лет (1,7 ф 0,2234)-10 клеток/мл,т.е. 1007-ная жизнеспособность клеток.П р и м е р 2. Клетки Гцзаг 1 цпшопх 11 Гогше Рдв объеме 1,5 мл,отмытые от ростовой среды, ресуспендировали в 3%-ном растворе сахарозы.Исходная концентрация клеток в образце (1,7+0,1435) 10 клеток/мл.После 10-минутной экспозиции образецохлаждали от 15 до -70 С со скоростью 1 ОС/мин. Затем образец погрузилив жидкий азот, После хранения в жццком азоте в течение 2 лет образцыотогрелк на водяной бане при 28 С.Количество жизнеспособных клеток(1,7 ф 0,3013)10 клеток/мл,П р и м е р 3. Образцы клетокГезагхцш шопх 11 гогше Р 8"7 в объеме1,1 мл, отмытые от ростовой среды(среды Чапека), ресуспендировали в57-ном водном растворе диметилсульфок,сида (ДИСО) . Исходная концентрацияклеток в образце (1,7+0,26 б 1) 10 клеток/мл. После 12-минутной экспозицииобразец охладили от 18 до -85 С соскоростью 2 С/мин. Затем образец поьгрузили в жидкий азот. После хранения образца в жидком азоте в течение2 лет его отогревали на водяной бане нри 28 С. Количество жизнеспособных клеток в образце после хранения 1, 7 0,2804 10 клеток/млили 100%.В таблице показано влияние скорости охлаждения и концентрации криопротекторов на жизнеспособность клеток Гцзаг 1 цш шопд 11 Гогше РнИсходная концентрация клеток 1,7 10 ф,Из таблицы видно, что высокая жизнеспособность достигается при охлаж1110799 Количество жизнеспособных тканей прискорости охлаждения, С/минО КонцентрацияХ Криопротекторы 1% 10 клеток/мл 10 клеток/мл 1,51 100 Глицерин 1,08 100 1,7 1,23 100 1,63 1,30 95,8 ДИСО 1,29 95,8 1,65 3 1,32 0,90 100 1,71,69 5 1 99,9 Сахароза 1,09 100 1,7 0,97 100 Продолжение таблицы Криопротек-торы Количество жизнеспособных тканей прискорости охлаждения, С/мин% 10 клеток/мл %мГлицерин 88,8 0,94 54,7 55 ь 2 0,93 57,6 63,5 1,03 60,5 0,98 1,18 69,4 72,3 6,91 53,5 1,06 76,4 62,3 0,17 10,0 ДМСО 75,8 1,26 0,23 13,5,77,0 77,6 1,31 0,19 Сахароза 0,76 52,9 44,7 0 64,1 1,26 74,1 0 31,7 0 57,0 0,54 0 ВНИИПИ Заказ 6263/21 Тираж 521 Подписное Филиал ППП пПатентф, г.Узгород, ул.Проектная, 4 3дении со скоростью 1"2 С в минутчопри концентрации 1-3% глицерина, либо 1-3% схарозы, либо 1-5% диметилсульфоксида. Таким образом, преимуществом пред" лагаемого способа является то, что он обеспечивает 100%-ную жизнеспособность клеток.