Способ определения моноформазана в ткани на гистологическом препарате

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 1054 191 аИ ГОСТА ПО ДЕ чногог. Ереване Р. П.хзтосЬешеВешке 1970 Р. "НИдегресгторЬоо 1974, 38,апйшегет"155-171,. Фиг.1 ВЕННЫИ КОМИТЕТ СССР ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЦТИ(71),Филиал Всесоюзного нацентра хирургии АМН СССР в(54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОНОФОРМАЗАНА В ТКАНИ НА ГИСТОЛОГИЧЕСКОМПРЕПАРАТЕ, включающий приготовлениекриостатных срезов, их инкубацию вферментном субстрате, остановку реакции и экстракцию моноформазана с последующей его спектрофотометрией,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью повышения точности способа,остановку реакции проводят 0,01 н.раствором соляной кислоты в течение0,5-1 мин, а экстракцию моноформазанаведут в абсолютном ацетоне в течение1-2 ч в темноте.,где Х - количество моноформазана; Д - показатели оптической плотности;Я - площадь среза. на покровные стекла. Далее их помещают в инкубационную среду, содержа 45Так, например, Х для С Г иТ , , Х СДГ ЛДГ щую соответствующий субстрат (сукциравны соответственно нат, лактат, изоцитрат, о-глицеро 0,052 фосфат, шлютамат и т.д.). Срезы ин 5 ЭО нм 0,203 - 0,42; б 10 15 Увели 0,062Л=5 ЭО нм 0,326 ф П р и м е р 2. 10-. 12 мкм криостатные срезы ткани миокарда помещают на 15 мин в инкубационную среду, далее промывают в воде. Затем срезы обрабатывают 0,01 н. НС 1 в течениемин, промывают в двух сменах дис 1 1091Изобретение относится к медицине,а именно к гистохимическому исследованию ферментов.Известен способ определения моно,Формазана в ткани на гистологическомпрепарате, включющий инкубацию тканив ферментном субстрате, окраску нитротетразолиевым синим и спектрофотометрическое выявление Формазанов вткани Г 13.10Однако данный способ не дает возможности выявить моноформазан, таккак продукт реакции обусловлен комплексом Формазанов.Наиболее близким к предлагаемомупо технической сущности являетсяспособ определения моноформазана вткани на гистологическом препарате,включающий приготовление криостатныхсрезов, их инкубацию в ферментномсусбстрате, остановку реакции и экстракцию моноформазана в абсолютном, алкоголе с последующей спектрофотометрией при 520-525 нм 2Однако экстракцйя моноформазанав абсолютном алкоголе не дает возможность полно экстрагировать егоиз ткани, что снижает точность определения активности фермента.Цель изобретения - повышение точ 30ности способа.Указанная цель достигается темчто согласно способу определениямоноформазана в ткани на гистологическом препарате остановку реакциипроводят 0,01 н. раствором солянойкислоты в течение 0,5-1 мии, а экстракцию моноформазона ведут в абсолютном ацетоне в течение 1-2 ч в темноте,Способ осуществляется следующимобразом,Свежезамороженные криостатныесрезы 10-12 мкм монтируют по четыреку ируют в течение - мин.чение времени инкубации больше 15 мин 50приводит. к непропорциональному отложению продукта реакции, а уменьшение - к снижению его количества.После инкубации срезы промывают дистиллированной водой, погружают на 550,5-1 мин в 0,01 н. НС 1 промываютв двух сменах дистиллированной водыи высушивают -3 мин при комнатной 054, 2температуре, Затем срезы для экстрах.ции моноформазана помещают в 3 млабсолютного ацетона, элюирование ведут при комнатной температуре в темноте в течейие 1-2 ч. Увеличение срока элюирования больше 2 ч приводитв силу испарения ацетона к повышениюконцентрации элюента и искаженйю результата анализа, Снижение. срока элюирования меньше 1 ч приводит к неполному выходу элюента, Определение концентрации элюента проводится наспектрофотометре, Для расчета количества моноформазана (Х) приводятсяпоказатели оптической плотности (Д)к площади среза (8),Спектральная характеристика моноформазана в абсолютном ацетоне харак"теризуется кривой с максимумом поглощения 530 нм (Фиг. 1 и 2). На фиг. 1показана спектральная характеристикамоноформазана в 70-100 о спирте и абсолютном ацетоне, наибольшая Ь и амплитуда кривой в абсолютном ацетоне.П р и м е р 1. Готовят 10-12 мкмкриостатные срезы миокарда, Срезыпомещают на 10 мин в инкубационнуюсреду, далее промывают в воде, затемобрабатывают 0,01 н, НС 1 в течение0,5 мин, промывают в двух сменах дистиллированной воды и высушивают прикомнатной температуре.Для определения площади срезаих проецируют на кальку и взвешивают (см 2 ),Элюирование моноформазана проводят 1 ч. Определение моноформазанав срезе проводят по формулеФин с ъСоставитель Л. Стебае ор Ю. Ковач Техред Т.Фанта орректор тяг аз 3073/40 ВНИИПИТираж 823арственногозобретенийЖ, Рау Подписиета СССРытийнаб., д. 4/5 Гос по делам 3035, Москоми отк кая Патент",иал зтиллированной воды и высушивают при комнатной температуре,Элюирование моноформазана прово. дят 2 ч, при этом Х для СДГ и ХДГ в этом случае равны соответственно. 0,058СДГИО нм 0 223 0259 0,069ЛДГ :лайм 0 310 0,222.э 1091054 4Применение предлагаемого способаобеспечивает более максимальное экстрагирование этого фермента из ткани,что повышает точность определениямоноформазана до 40,57, по сравнениюс известным (80,67).Изобретение найдет применение вклинических лабораториях при оценкеактивности окислительно-восстанови 10 тельных ферментов в ткани, являющихся ключевыми в энергетическом обменеклеток,город, ул. Проектная, 4