Способ получения флуоресцентного фосфатидилхолина

.09.8201.84. БюВ. БогомоШвецсковский оо Знаменикой технол дена Трудовогонститут тонкойгии им. М. В. Ло 088.8)й Ю. Г. и дрсцентномеченых(71) Мо рКрасног ихимичес омоносова(54 ) (57 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ФОСФАТИДИЛХОЛИНА с использованием природного фосфатидилхолинаи антрацена, о т л и ч а ю щ и й -с я тем, что, с целью упрощенияспособа, природный фосфатидилхолинподвергают взаимодействию с антраценом в присутствии безводного хлористого алюминия при их мольном соотношении, равном 1:1 1 ."1, 5:1,8-2,5, всреде безводногодихлорэтана при 1825 оС.Изобретение относится к химии фосфорорганических соединений, а именнок новому способу получения флуоресцентного фосфатидилхолина, которыйможет найти применение в качествефлуоресцентного зонда в молекулярнойбиологии и в медицине.Известен способ получения флуоресцентного фосфатидилхолина, а именно 1-ацил-,9 т(9-антроил)-11-аминоундеканои+Бп-глицеро-фосфохолина, 10который заключается в том, что 11-аминоундекановую кислоту метилируютабсолютным метанолом в присутствииконцентрированной серной кислоты,образующийся с количественным выходом метиловый эфир 11-аминоундекановой кислоты подвергают взаимодействию с хлорангидридом антрацен-карбоновой кислоты. Получающийсяс выходом 48-ный метиловый эфирИ-(9-антроил )-11-аминоундекановойкислоты омыляют раствором гидроокиси натрия и образующуюся свободнуюИ-(9-антроил)-11-аминоундекановуюкислоту (вырд 79) подвергают взаимодействию с лизофосфатидилхолиномв присутствии тионилхлорида. Лизофосфатидилхолин получают ферментативным гидролизом фосфатидилхолинаяичного желтка фосфолипазой А свыходом 80 1-Ацил-ГИ-(9-антроил )-11-аминоундеканоил-во-глицеро-фосфохолин получается с выходом30 в виде желтоватой воскообразноймассы, Продукт имеет следующие характеристики: ВГ 0,4 в системе хлороформ-метанол-вода (65:25:4);спектр флуоресценции (в этаноле 3 щщ369 нм): Ьмма.исдчвс. 388,407 и 430 нм 11 .Недостатками укаэанного способа 40 являются многостадийность процесса, и использование дорогостоящего фермента фосфолипазы Аъ.Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату 45 к предлагаемому является способ получения флуоресцентного фосфатидилхолина, а именно 1-ацил- 11-(2-антроил )-ундеканоил - Бп-глицеро-фос; фохолина, основанный на использовании природного фосфатидилхолина и антрацена. Однако природный фосфатидилхолин яичного желтка предваритель,но подвергают гидролиэу фосфолипазой Аг с получением лиэофосфатидилхолина, а антрацен ацилируют смешанным ангидридом додекан,12-диовой и ортокремневой кислот образующимся непосредственно в реакционной массе при смешении додекан,12-диовой кислоты с тетрахлоридом,кремния в нитробенэоле 60 в присутствии безводного хлористого алюминия, Далее образующуюся с выходом 41 11-(2-антроил )-ундекановую кислоту подвергают взаимодействию с ,лизофосфатидилхолином в присутствии М, Н -оца - (имидаэол ) кетона в средехлороформа,1-Ацил-(11-(2-антроил)-ундеканоил(-яи-глицеро-фосфохолин выделяютпрепаративной тонкослойной хроматографией в виде желтоватой воскооб- разной массы с выходом 50. в 0,4в системе хлороформ-метанол-вода(65; 25: 4 ); УФ-спек гр/Л мака, нмЙ//: 265 (1,510 ), 388 (1,1 хх 10 ); спектр флуоресценции (в этаноле 3 Ьазб, 265 нм ); Э мюе.исо кк.455 нм.Для использования полученного флуоресцентного фосфатидилхолина в качестве флуоресцентного зонда его необходимо смешивать с природным фосфатидилхолином в весовых соотношениях 1:10-200. Смесн, содержащаяфлуоресцентный и природный фосфатидилхолины в соотношении 1:10, имеетследующие характеристики: ВГ 0,4в системе хлороформ-метанол-вода(65:25:4); Уф-спектр 3 г,дко /Е //265/1500 ), 388 (110 ); спектр флуоресценции (в этаноле,2 возб. 265 нм3 макс. испуск. 455 нм 23.Недостатками известного способаявляются многостадийность, использование дорогостоящего фермента фосфолипазы А и дефицитного реагентакарбонилдииглидаэола.Целью изобретения является упрощение способа получения флуоресцентно-го фосфатидилхолина.Поставленная цель достигается тем,что согласно способу получения флуоресцентного фосфатидилхолина, заклю-,чающемуся в том, что природный фосфатидилхолин подвергают взаимодейст,вию с антраценом в присутствии хлористого алюминия при их мольном соотношении, равном 1,0:1,1-1,5:1,82,5, в среде безводного дихлорэтанапри .1 8- 2 5 а С.Целевой продукт выделяют хромотографией в виде желтоватой воскообразной массы с выходом 78-80,При проведении процесса при температуре ниже 18 С реакция идет оченьмедленно. Повышение температуры выше 25 С приводит к некоторому уменьшению выхода целевого продукта вследствие большего образования нефлуоресцирующих продуктов, что осложняеточистку целевого продукта. Количество антрацена обусловлено тем, чтопри мольном соотношении фосфатидилхолин-антрацен, меньшем, чем 1:1,1,падает выход продукта реакции, апримольном соотношении фосфатидилхолин:антрацен, большем, чем 1:1,5, увеличивается расход антрацена без увеличения выхода целевого продукта. Примольном соотношении фосфатидилхолин;.хлористый алюминий меньшем, чем 1."1,8реакция не идет, а при соотношениибольшем, чем 1:2,5, резко возраста1068441 ет образование продуктов деструкциифосфатидилхоли на.Получающийся продукт. имеет следующие характеристики: НГ 0,4 в системе хлороформ-метанол-вода (65:25;4); Уф-спектр,). макс., нм ///350 (196), 365 (177), 386 (137);спектр флуоресценции (в дихлорэтане,Х возб. 365 нм); 3 макс. испуск.420 нм; соотношение флуоресцентногои исходного фосфатидилхолина 1:10. 10 3 25 1: 3,5:2,579Таким образом, для испоЛьзованияпредлагаемого флуоресцентного фосфа 17 1:1,0:1,7тидилхолина в качестве флуоресцентного зонда нужно брать природногофосфатидилхолина для разбавления в 1510 раз меньше, чем в случае известного продукта.П р и м е р 1. 67,9 глг(0,085 ммоль) Фбсфатидилхолина ку.- риного желтка и 16,6 мг (0,094 ммоль)20антрацена растворяют в 2,.5 мл безводного дихлорэтана и при перемешивании прибавляют 20,4 мг(0,153 ммоль) безводного хлористогоалюминия. Реакционную смесь перемешивают в течение двух часов при 18 Са затем разделяют с помощью препаративной тонкослойной хроматографиив системе хлороформ-метанол-вода(177), 386 (137); спектр флуоресценции (в,дихлорэтане, 3 возб. 365 нмД макс. испуск. 420 нм,В таблице представлены примеры 40получения флуоресцентного Фосфатидилхолина при различных мольных соотношениях реагентов и температурепроцесса (порядок смешения реагентови условия выделения целевогопродукта такие же, как впримере 1 1 18 1:1,1:1,8 78 2 20 1:1,3:2,2 80 5 26 1:1,6:2,6 . 66 Составитель М. КрасновскаяРедактор Г. Волкова ТехредМ.Гергель Корректор М., Лароши Заказ 11390/20 Тираж 638 . Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5,ЖФилиал ППП "Патентп, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 В примерах 2-5 порядок смешенияреагентов и условия выделения продух 5 Отов реакции такие же, как и в приме-ре 1. На примере модельной системы: липосомах из яичного фосфатидилхолина с Б-стеароилтриптофаном и флуоресцент ным фосфатидилхолином (И-стеароилтриптофан использовали в качестве модели мембранного белка с поверхностной локализацией центра масс триптофанов)показано, что полученный предлагаемым способом флуоресцентный Фосфатидилхолин может быть использован как акцептор энергии при исследовании различных липид-белковых комплексов методом фиксации индуктивнорезонансного переноса энергии. с ароматических аминокислот.Липосоьы готовили по методу Бэнгхэма Г 33: яичный .Фосфатидилхолин-Н- -стеароилтриптофан (200:1); яичный фосфатидилхолин-Флуоресцентный фосфатидилхолин (200:10); яичный фосфа- тидилхолин-М-стеароилтриптофан-флуоресцентный фосфатидилхолин(200:1: 10),Затем фиксировали спектры флуоре- сценции всех трех образцов,при З возб. 285 нм (на спектр спектрофлуориметре "Н 1 сасЬ МРГ, Япония, ширина щели 2 нм), При введении флуоресцентного фосфатидилхолина в липосоьы, содержащие И-стеароилтриптофан, наблюдается уменьшение Флуоресценции триптофана (350 нм) и увеличение флуоресценции фосфатидилхолина (412 нм).Таким образом, предлагаемый способ позволяет упростить процесс получения флуоресцентного фосфатидилхолина эа счет исключения дорогостоящего Фермента фосфолипазы А 2 ц проведения процесса в одну стадию.