Способ выделения гиалуронидазы

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК О 49 26; С 12 В 1/4 3(51) С 1 ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН или,опреой н" с ьй вой. -н970,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИ(71) Институт биохимии растенийАН Грузинской ССР и Тбилисскийнаучно-исследовательский институвакцин и сывороток(56) 1. Авторское свидетельствоР 632703, кл. С 12 И 9/26,1977.2. Трояшкин А.А. Получение иделение активности стафилококковгиалуронидазы. Труды Ленинградскго санитарно-гигиенического медиститута, 1978, т,120, с. 80-82.3. Климачева Л,В. и Исполатинкая М.В. Выделение и некоторые сства гиалуронидазы С 0,регйг 1 пдепВопросы медицинской химииф, 1т, ХУ 1, вып.4, с.381,-386.(54)(57) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ГИАЛУРОНИДАЗЫ из культуральной жидкости патогенного штамма-продуцента путемосаждения фермента этиловым спиртом в соотношении 1:1, отделения .ирастворения осадка с последующейхроматографической очисткой на полисахаридном сорбенте, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения чистоты целевого продукта, используют культуральную жидкость штамма БарпуРососсцэ аРЬпв 0-15, в ка"честве сорбента используют диэтил.аминоэтилцеллюлозу,причем при хрома.тографии сорбцию ведут в условиях0,006 М фосфатного буфера с рН7,0-7,2, а элюцию осуществляют 0,06 Мфосфатным буфером при тех же значениях рн.Изобретение относится к Фермецтнбй промышленности, в частности кспособам получения высокоочищеннойгиалуронидазы из патогенных микроорганизмов.Известны способы получения тести 4кулярной гиалуроцидазы, в частностигиалуронидазы из бычьих семенникон,из хрусталика глаза .1 3.Однако указанное сырье являетсядорогостоящим и дефицитным, что ограничивает получение фермента в достаточном количестве.Известны также способы получениягиалуроцидазы на основе микроорганизмов как патогенных так и непатогенных.Среди непатогенных микроорганизмов редко встречаются продуцентыгиалуронидазы. Более распространенными являются способы выделения гиалуронидазы из культуральцых жидкостей патогенных микробов,Известен способ выделения гиалуроцидазы из культуральцсй жидкостипатогенного штамма стафилоксккапутем осаждения Фермента сернскислыми солями,случают нео ппщенцый фермецтцыйпрепарат, выход и активность которого не охарактеризованы 2 7.Наиболее близким к цзсбртениюпс технической сущности ц достигаемому эффекту является способ выделения гиалуронидазы из культуральцсй жидости патогенного штамма-продуцента С".сзГ 1:1 с 11 цщ регйл 1 п -уепз путем осаждения с рльФатсм аммония, диализа, повторного осаждениясульфатом аммония, растворенияосадка, осаждения зтилсвым спиртомпри соотношении 1:1, тделеция ирастворения осаца ;: последующейхроматографическсй очисткой ца диэтиламинсэтилсефадексе Л, причемсобцию ведут в условиях 0,1 М трисбуфера (рН 7,5), а злюцию осуществляют 1 М МаСР в том же буфере ГЗ .Получаемый продукт обладает значительной чистотой,. однако при проверке чистоты выделенной гиалурснидазы методом злектрофореза установлено, что оца состоит из двух злектрофоретических фракций.Цель изобретения - повышение чистоты целевого продукта.Указанная цель достигается предлагаемым способом выделения гиалуронидазы из культуральной жидкостипатогенного штамма-продуцента путемосаждения Фермента этиловым спиртом в соотношении 1;1, отделенияи растворения осадка с последующейхроматографической очисткой на полисахаридном сорбенте, причем используют культуральную жидкость штамма БарЬу 0 ососсцв аЬцн 0-15, н качестве сорбента используют диэтиламинозтилцеллюлозу, причем при хроматографии сорбцию ведут в условиях0,006 М Фосфатного буФера с рН7,0-7,20,а элюцию осуществляют 0,06 МФосфатным буфером при тех же зна 5 чениях рН,Предлагаемый способ позволяет отделить примесные белки и сопутствующие токсины и получить электрофоретически гомогенную гиалуронидазу,10 что обусловлено свойствами культуральной жидкости указанного штаммаи определенными условиями хроматографии.Кроме того, предлагаемый способявляется более простым, состоит изменьшего числа стадий, чем изнестный.П р и м е р. Продуцент В 1.азиз0-15 культивируют н течение 5 сутца среде, содержащей кислотный гидролиэат козеина, экстракт отрубей,дрожжевой экстракт и однозамещенныйфосфат калия.Микробные клетки отделяют сепарированием, К 1 л культуральнсйжидкости добавляют 1 л охлажденного963-ного этилового спирта, выдерживают в холодильнике 30 мин, центри"Фугируют при 3000 об/мин в течениеО мцн. Осадок растворяют в 50 мл30дистиллированной воды и лиофильновысушивают Получают порошок с активностью около 12 ед/мг.Выход фермента по активностисоставляет около 90 от исходной35 активности н культуральной жидкости Из 1 л культуральной жидкости получают 1,070 г лиофильно высушенного Ферментного препарата.100 мг полученного ферментногопрепарата растворяют в 0,006 М ФосФатном буфере с рН 7,0 и наносятца колонку с ДЭАВ-целлюлозой вОН -Форме. Высота колонки 22 см,высота слоя 15 см, диаметр колонки2 см, скорость нанесения 1 капля в15 с, Недсорбнрованцый белок выливают из колонки тем же буфером, Активную фракцию гиалурснидазы эллюируют фосфатным буфером с рН 7,0 иионной силой 0,06 М, В элюате удель.ная активность гиалуронидазы составляет 72 ед/мг белка. Элюат высушивают лиофильно.Активность гиалуронидазы определяют турбидиметрическим методом,Гомогенность полученного ферментаопределяют электрофорезом в полиакриламидцом геле при кислом и щелочном значениях рН среды.Выделенная гиалуронидаза электроб 0 форетически гомогенна, имеет активность 67000-120000 турбидиметрических единиц на 1 г.Выход целевого продукта 62 посравнению с исходной активностью н65 культуральной жидкости.1049544 Составитель О.СкородумоваРедактор Г.Безвершенко Техред Т.ынта Корректор Л. Патай Заказ 8361/28 Тираж. 523 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, 3-35, Рауыская наб., д. 4/5Филиал ППП 11 Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Таким образом, предлагаемый способ получения фермента гиалуронидазы легко воспроизводим и не требует специального сложного аппаратурного оформления. Фермент гиалуронидаза, полученный предлагаемым способом, Обладает высокой удельной активностью, гомогенен злектрофоретически и полностью свободен от токсических компонентов,