Способ количественного определения коэнзима а в лейкоцитах

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 1040412 ОМИТЕТ СССРНИЙ И ОТКРЫТИЙ ГОСУДАРСТВЕНН ПО ДЕЛАМ ИЭОБ АНИЕ ИЗОБРЕ КОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ К АВ/ (21) 2662824/28-13. проведения реакции ацетилирования (22) 04.09.78 с использованием и -аминобензойной (46) 07.09.83. Бюл.РЗЗ кислоты с последующим внесением ре- (72) А.Г. Мойсеенок, М,А Рыбалко,-: .агента для определения продуктов ;Е.А. Цвербаум и В.Н. Петровацетилирования, по количеству кото) Отдел Регуляции обмена веществ,. ,рых определяют количественное содер- АН БелорУссКой ССР и Иркутский го- . аание коэнзима:А, о т л и ч а юсударственный медицинский институт ,; щ и й с я тем, что, с целью повиае- (53) 615.361.,014.41(088.8) ния точности способаг лейкоциты пред- (56) 1. М.М. Алимова, Г.А. Михеева.,;, варительно до проведения реакции аце"Исследование ацетилирующей способное тилирования кипятят с водой, с обрати крови 1 п Иго", ж.Лабораторное .зовавшимся экстрактом проводят реакдело, М., Медицина, ВЗ, 1965,.:. цию ацетилирования путем дополнитель:с.159-160. ного внесения ацетонового порошкапечени, а в качестве реагента для (54)(57) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕ-. определения продукта ацетнлировання ДЕЛЕНИЯ КОЭНЗИМА А В ЛЕЙКОЦИТАХ путем, используют,п -диметилбензальдегид,Изобретение относится к биологии 1 М раствора ацетата натрия, 2 мли медицине и может быть использовано 0,2 М раствора цитрата натрия 0,1 млпри экспериментальных и клинических Я 1 М раствора солянокислого цистеинаисследованиях для определения коэнзи- и 0,1 мл 1 М свежеприготовленного растиа А. вора бикарбоната натрня и 0,25-0,5 млИзвестен способ количественного 5 10-ного раствора ацетонового порошопределения коэнзима А (КоА) в тканях ка печени в 0,02 М растворе бикарбо(лейкоцитах ) путем проведения реакции ната натрия,ацетилирования с. использованием Содержимое пробирки тщательно пере-аминобензойной кислоты (ПАЕК) с пос- мешивается и инкубируется 1 ч прии-амиледующим внесением реагента для опре 37 С. Реакция останавливается доба -40 овделения продуктов ацвтилирования, лением 1 мл 15 раствора трихлоруксуспо количеству которых определяют ко- ной кислоты, пробы центрифугируютсяличественное содержание кознзима 11 3. 15 мин при 3000 об/мин.Однако известный способ не являет- . К 0,5 мл центрифугата добавляются достаточно точным вследствие не- .15 1 мл воды и 0,5 мл 5 н. Раствора солядостаточной интенсивности реакции ,ной кислоты, Вносят 2 мл свежеприцетилирования нативными лейкоцитами готовленного 2 спиртового раствораи развития у них дополнительной окрас- и-диметиламинобензальдегида. Пробыки для определения продуктов ацетили- через 15 мин колориметрируются прирования. 453:нм кювета 5 мм. Количество сво 20 фЦель изобретения - повышение точ- бодной ПАБК в исследуемых пробахности способа количественново опреде- определяется по калибровочной кривой.ения КоА) в лейкоцитах, В качестве контроля используютсялПоставленная цель достигается тем, . пробы, в которых трихлоруксус аянаят согласно способу количественного 25 кислота вносится перед инкубацией.ссчитыопределения КоА в лейкоцитах, включаю- В каждой отдельной пробе рассчищему проведение реакции ацетилирования, вается количество ацетилированнойс использованием и -аминобензойной ПАБК разница между контролем икислоты с последующим внесением реа- опытом ) в мкг на. 1 млн. лейкоцитовгента для определения продуктов ацети- за 1 ч инкубации. При наличии образлирования, по количеству которых ца КоА ацетилирующая активностьопределяют количественное содержание выражается в нг КоА на 1 млн лейкоКоА, предварительно до проведения цитов.реакции ацетилирования лейкоциты ки-П р и м е р., Для определения воз"пятят с водой, с образовавшимся экст, можности использования способа какрактом проводят реакцию ацетилирова З 5 критерия оценки обеспеченности органия путем дополнительного внесения низма человека пантотеновой кислотойацетонового порошка. печени, а в обследовали 4 группы лиц: 1-я - здорокачестве реагента для определения вые доноры, получающие обычное сбапродукта ацетилирования используют лансированное питание, 2-я - здоровдиметилбензальдегид. 40 вые доноры, получающие, обычное пита"Способ осуществляют следующим ние и однократную энтеральную нагрузку 200 мг пантотената кальция, .3-яК 5 мл венозной крови добавляют здоровые доноры, получающие обычное1 каплю раствора гепарина (1 ХБ 1 )питание и однократную парентеральнуюи 1 25 мл 6-ного раствоРа средне" 45 нагрузку 200 мг пантотената кальция,Ре Некулярного полиглюкина, осторож о 4 я - больные хроническим алкоголизперемешивают и помещают в стакан , мом, характеризующихся вторичнойсо льдом на 1-1,5 ч. Плазма со вэвеэндогенной ) недостаточностью пантошенными в ней лейкоцитами отсасываетпипеъфкой и осле подсчета коли цчества формо енных элементов центриу метода избраны соответствие измененийфугируется а ол д ри ется на холоде при 3000 об/мине мин, К осадку лейкоцитов Уро вня КоА в лейкоцитах характеруают мл д обеспеченности организма паитотеноЭойприливают мл дают 1 мл дистиллированнойкислотой и соответствие измененийасти ают стеклянной палочкойипятят на водяной бане 7-8 мин. 55 показателя суммарному содержаниюи кипятят на дямикробиологически определяемых формпантотената в экстракте лейкоцентрифугируется, и в количестве0,25-0,5 мл используется для авалиВ стеклянную пробирку помещают 60 В таблице приводятся результаты0,25-0 5 мл прозрачного лейколизата, исследования.У0,2-0,5 мп инкубационной смеси,0,3 мл ацетилирующей смеси, содержа-Представленные данные подтверждают адекватность реакции уровня КоА1,6 мл 0,05 М раствора АТФ 0 5 мл 65 в лейкоцитах состоянию обеспеченности1040412 Предлагаемый способ определенКя кознзима А-прост, надежен,позволяет определить содержание КоА в лейкоцитах с высокой точность о и в короткий срок. организма пантотеновой кислотой ипрямо коррелируют с содержанием микробиологически опРеделяемых форм витамина в лейкоцитах. Обследуемаягруппа Количество наблюдений Количествоацетилированной ПАБКйа 1 млн.лей,коцитов нг 73,2+3, 7166,5+6,953,9728,3+1,5 Составитель Л. Морозова Редактор .Л. Пчелинская Рехред Т.фанта Корректор О. Тигор Ю Заказ 6921/48Уираж 873 . . Подписное ВНИИПИ Государственного. комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, 3-35, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП фПатентф, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 20 10 12 ч 0 Количество . КоА на1 мпн,лейкоцитов , нг66,1+3,3150,3+6,2139,2+6,4 25,511,5 Количествообщей пантотеновойкислоты на 1 млн.лейкоцитов, нг 89,414,9179,6+7,7168,8+7,834,6-1,35