Способ определения иммуноглобулинов человека

Изобретение относится к иммунохимии и может быть использовано для клинического анализа иммуноглобулинов (Уд) в биологических жидкостях.Известен способ радиальной иммунодиффузии, который основан на визуальном определении комплекса, образующегося при специфическом взаимодействии Уд из анализируемого образца с антителами против определяемого Уг в процессе диффузии реагентов в слое геля 1.Указанныйметод обладает невысокой чувствительностью, длительным временем анализа (1 сут).Наиболее близким к предлагаемому является способ анализа Уд человека в сыво ротке крови, который предусматривает инкубацию исследуемой сыворотки со специфическими антителами, иммобилизованными на сефарозе 2.Однако указанный метод трудоемок, его проведение включает две промывки иммуносорбента, что занимает много времени и приводит к возрастанию ошибок измерения вследствие неизбежных потерь носителя при обмывке. Определение ферментативной активности проводят на носителе, чем услож няют процесс автоматизациии метода. Большой расход дорогостоящего меченого фермента приводит к высокой стоимости анализа, что осложняет проведение массовых обследований.Цель изобретения - упрощение спосо ба и сокращение времени анализа.Указанная цель достигается тем, что при осуществлении способа определения иммуноглобулинов человека путем инкубации исследуемой сыворотки крови человека со специфическими антителами, иммобилизован- З 5 ными на нерастворимом носителе, инкубацию исследуемой сыворотки осуществляют со специфическими антителами, иммобилизованными на силохроме с размером частиц 30 - 40 мкм.40Способ осуществляют следующим образом.Сыворотку крови человека инкубируют с иммобилизованными на силохроме специфическими антителами и ферментным коньюгатом, содержащим Уд, меченый перо ксидазой, На поверхности сорбента одновременно протекают две конкурирующие реакции: связывание антителами свободного Уд из сыворотки крови и Уд, меченного пероксидазой. После установления равновесия в системе измеряют остаточную ферментативную активность надосадочной жидкости, Содержание, Уд в исследуемом образце определяют с помощью калибровочного графика, полученного при использовании стандартных препаратов Уй. 55Пример 1. Получение антител, иммобилизованных на силохроме. Используют сыворотку крови кроликов, иммунизированных очищенным препаратом Уд человека. Глобулиновую фракцию сыворотки крови выделяют двукратным осаждением 20 О/о-ным водным оаствором полиэтиленгликоля (м. в. 6000).Неорганический носитель силохром С - 20 МК активируют кипячением в 2 О/о-ном растворе у -аминопропилтриэтоксилана в безводном толуоле. Аминированный силохром инкубируют с 1 О/,-ным водным раствором глутарового альдегида.К 1 г активированного силохрома добавляют 60 мг глобулиновой фракции в 10 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 7,4 с 0,1 м ХаС 1 и 0,025/О тритона Х - 305. Смесь инкубируют 3 ч, после чего сорбент трижды промывают фосфатным буфером и гомогенизируют до образования однородной суспензии, Сорбент хранят в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,4, с 0,1 М ИаС при 4 С. В течение 10 мес антитела на сорбенте не теряют иммунологической активности.Получение комплекса 1 дб с пероксида. зой.Используют коммерческий препарат 1 дб производства института им Н. Ф. Гамалеи и пероксидазу фирмы Кепа, Перед использованием фермент очищают до КХметодами ионообменной хроматографии и гель- фильтрации. Комплекс 1 дб-пероксидаза получают методом окисления углеводородного компонента фермента периодатом натрия.5 мг пероксидазы растворяют в 1 мл 0,3 М бикарбоната натрия рН 8,1 и добавляют 0,1 мл 1 О/о-ного раствора фтординитробензола в абсолютном этаноле. После инкубации 1 ч добавляют 1 мл 0,08 М раствора периодата натрия рН 6,2 и через 30 мин 1 мл 0,16 М раствора этиленгликоля в воде. Смесь инкубируют 1 ч и отдиализовывают при 4 С против 0,01 М карбонатного буфера рН 9,5. К раствору модифицированного фермента добавляют 10 мг 1 дб человека в 0,2 мл трис-НС буфере рН 8 Ъ 6. Смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре и добавляют 5 мг боргидрида натрия. Через 2 ч проводят диализ против 0,1 М фосфатного буфера рН 7,4 с 0,1 м ЫаС. Комплекс выделяют гель-фильтрацией на колонне с сефадексом С в 2 (100 х 1,5 см), уравновешенным тем же буфером.Определение иммуноглобулина С (1 дб) в сыворотке крови человека.В серию инкубационных пробирок дозиметрируют по 0,02 мл суспензии силохрома с размером частиц 30 - 40 мкм. С иммобилизованными антителами 0,1 м разведенной в 6000 раз измеряемой сыворотки и 0,1 мл комплекса 1 дб-пероксидазы (4,3 10 мол) Общий объем в пробирках доводят до 1 мл 0,01 М фосфатным буфером рН 7,4, содержащим 0,1 М ИаС и 0,025/о тритона Х - 305. Смесь инкубируют при перемешивании 2,5 ч. Затем к 0,3 мл надосадочного раствора до1025430 Составитель И. Косова Редактор А,Мотыль Техред И. Верес Корректор А. Дзятко Заказ 4443/5 Тираж 713 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб д. 4/5 Филиал ППП Патент, г, Ужгород, ул. Проектная, 4бавляют 0,05 мл спиртового раствора о-дианизидина (104 М), 0,3 мл буфера рН 2,7;0,2 мл Н О (1,3 1 О 4 М) и в течение 30 с измеряют начальную скорость ферментативной реакции на автоматическом анализаторе скоростей реакций. Пересчет начальной скорости в концентрацию измеряемого 11 зУ производят по калибровочному графику, полученному со стандартным препаратом сыворотки крови, содержащим известное количество 1 цб (12,8 мг/мл).10Пример 2. Получение комплекса 10 А с пероксидазой, 11 УА выделяют из глобулиновой фракции сыворотки крови больного А-миеломой методами гель-хроматографии на С - 200 и ионообменной хроматографии15 на ДЕАЕ-сефадексе. Для получения комплекса 1 дЛ пероксидаза 6 мл фермента растворяют в 1 мл 0,3 М бикарбоната натрия РН 8,1) и добавлЯют 0,1 мл 1 о/о-ного РаствоРа фтоРди нитробензола в абсолютном этаноле. Инкубируют 1 ч и добавляют 1 мл 0,08 М периодата натрия (рН 6,2). После 30 мин инкубации реакцию останавливают добавлением 1 мл 0,16 м этиленгликоля. Смесь инкубируют в течение 1 ч и диализуют против 0,01 М карбонатного буфера рН 95. К отдиализованному раствору добавляют 12 мг 1 дА в 0,2 мг трист-НС 1 буфере (рН 8,6) Инкубируют смесь 2,5 ч и диализуют при 4 С против 0,01 М фосфатного буфера рН 7,430 с 0,1 М МаС 1. После диализа комплекс выделяют гель-фильтрацией на колонке с сефадексом С - 200 (1,5 100 см), уравновешенном тем же буфером. Определение 1 дА в сыворотке крови человека.В серию инкубационных пробирок дозируют по 0,02 мл суспензии силохрома с иммобилизованными антителами, 0,1. мл комплекса 1 дА-пероксидаза. и 0,1 мл сыворотки, разведенной в 400 раз. Определение проводят по схеме, приведенной в примере .Таким образом, предлагаемый способ позволяет сократить время анализа, по сравнению с прототипом, в четыре раза, производить анализ в одну стадию, что приводит к снижению ошибки измерения, значительно облегчает действие оператора, увеличивает производительность. Способ предусматривает уменьшение расхода дефицитных и дорогостоящих реагентов. Например, наличие 1 г иммуносорбента на основе силохрома, содержащего 5 мг антител, дает возможность обследовать 3300 сывороток, при этом расходуется лишь 0,12 мг связанной с 1 д-пероксидазы. Иммобилизованные на силохроме антитела используют для анализа в течение 1 года, а комплекс 1 д - ПХ более 2 -х лет. Для проведения анализа клинической лаборатории не требуется особое оборудование, так как измерение ферментативной активности может осуществлять простейшим спектрофобометром, фотоэлектрокалориметром или по индикаторной шкале зависимости интенсивности окрашивания продукта фрементативной реакции от дозы определяемого 1 д.Предлагаемый способ может найти широкое применение в клинической практике для проведения массовых анализов содержания 1 д в сыворотке крови человека.