Способ получения аденозин-5 -трифосфата

СОЮЗ СОВЕТСКИХ ОЦИАЛИСТИЧЕСК СПУБЛИК(71) Куреха Кагаку а и о Такс бусики Ка фос. рас-. рной ьиную кис. 4 Ь ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТЮ ИСАНИЕ ИЗОБР.кл, 36 Н 3, опублик. 1966.2, Патент Японии Хо 49 - 28996,кл, С 12 О 13/06, опублик. 1974.(54)(57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДЕНО.ЗИН 5 -ТРИФОСФАТА, предусматривающийкультивирование продуцируюших его микроорганизмов на питательной среде, содержащейсубстрат и неорганический фосфат, представленный (МН 4)/1 РО 4, К НРО 4. и КН РО 4,накопление целевого продукта иего выделе.ние, о т л и ч а ю ш и й с я тем, что, с це лью снижения себестоимости целевого продукта, в качестве нродуцирующего микроорганизма используют метанолусваиваюшие штаммыРготапзпоЬастег пзетЬаоо 1 АТСС 2 1275, Согупо.Ьастегцв яр. 21232 Вас 11 цв сегцв АТСС14579, ГЛетЬу 1 отопав ргоЬцв РЕЯМ - Р,МетЬу 1 опзопав пзетЬу 1 очога АТСС 21369,Рвецдопюпав ветЬапо 1 са АТСС 21704, Рвецдотопав пвцета АТСС 21276, РвецдопюпэвгпетЬапка АТСС 21439 или РготапнпоЬастеггцЬег АТСС 8457, питательная среда содержитв качестве субстрата метанол или химическуюсубстанцию, иь.еющую такой же маршрут ме.таболизма, как и метанол, и представленнуюметаном, метиламином, формальдегидом, имуравьиной кислотой, а неорганическийфат используют в количестве 4 - 35 г/л,считанном относительно радикала фосфокислоты РО 4,2, Способ по п 1, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что метанол и метиламин вводятв количестве 0,2 - 4,0 об.%, а муравлоту и формальдегид. - 0,01 - 0,1 об.%114461 10 Изобрегснис относится к гехнической мик.робиологии н касастея способа полученияаденозин 5 .трифосфата, использующего про/дуцирунлцие бактерии, способные ассимилировать метанол.5И:игсстсц фсрмснативный способ полученияадснозин.трифосфата (АТФ) путем культивирования бактерии Вгеч 1 Ьастегшпз апзгпопаде -пев АТСС 6871 на питательной среде, содержащей источник фосфата, аденин или его про.изводпыс при рН среды 7,0, температура20 - 40 С. Выход ЛТФ 3 г/л 111.Известен закже способ получения АТФ,предусматривающий культивирование продуцента ВгехЬас 1 егагп агпгпоп 1 адепез АТСС 6872на питательной среде, содержащей субстрати неорганический источник фосфата, представ.ленный (МН ) НРО 4, К НРО 4 и КНРО 4 при30 С рН 6 А йакопление целевого продуктаои выделение в количестве 6,2 - 8,6 мг/мл 12).Недостатком известных способов являетсято, что обязательным условием биосинтезапродуцента является наличие в среде аденинаили его производного, такого как аденозин,используемого в качестве субстрата.25Цель изобретенияснижение себестоимостицелевого продукта.Поставленная цель достигается тем, чтопри способе получения аденозин.5 .трифосфаза,предусматривающем культивирование продуци 30руюших его микроорганизмов на питательнойсреде, содержащей субстрат и неорганическийфосфат, представленный (ИН 4) НРО 4, КПРО,и КН РО 4, накопление целевого продукта иего выделение, в качестве продуцирующегомикроорганизма используют метанолусваивающие штаммы Рготагп 1 поЬасСег гпетЬапо 1 АТСС21276, СогупоЬастеггцгп зр, 21232, Вас 1105сегоня АТСС 14579, ЦетЬу 1 огпопаа ргоЬивРЕЯМ Р - 3139, 1 у 1 етЬу 1 опзопаа гпетбу 1 очогаАТСС 21369, Ряецс 1 огпопаь пзетпапо 1 са АТСС21704, Ряеидогпопазпинцета АТСС 21276,Рвеодовопаз теФап 1 са АТСС 21439 илиРготагп 1 поЬастег гцЬег АТСС 8467, питательнаясреда содержит в качестве субстрата метанолили химическую субстанцию, имеющуютакой же маршрут метаболизма, как и метанол,и представленную метаном, метцламином, фор.мальдегидом и муравьиной кислотой, а неорга.иический фосфат используют в количестве 4 -35 г/л, рассчитанном отиосительно радикала 50фосфорной кислоты РО 4,Метанол и метиламин вводят в количестве0,2 - 4,0 об,%, а муравьиную кислоту и формальдегид - 0,01 - 0,1 об.%,Сущность изобретения заключается в том, 55что один из перечисленных метанолусваиваю щих штаммов культивируется в среде, содержащей метанол или химическое вещество,9 1имснццее то 1 же метаболический (уть, чго и метанол, и неорганический фосфат в количестве 4-35 г/л, рассчитанном по числу РО 4. Метанол или указанное химическое вещество используют в качестве источника углерода в сре. де, однако слишком высокая концентрация этого вещества в среде неблагоприятно сказывается на росте бактерий. Концентрация указанного вещества в среде обычно должна быть в пре. делах 0,2 - 4 об.% в слу ае метанола и метил. амина и в пределах 0,01-0,1 об,% в случае муравьиной кислоты и формальдегида. Если используют метан, то его концентрация соот. ветствует его растворимости.Подобный источник углерода может быть добавлен целиком одновременно в среду в начале культивирования, однако лучший резуль тат по отношению к выходу АТФ получают путем первоначального поддерживания в среде низкой концентрации источника углерода и дополнительного добавления в среду источника углерода по мере его потребления в процессе культивирования. При этом важно иметь неорганический фосфат, содержащийся в среде в концентрации 4 - 35 г/л, рассчитанной по числу РО 4, в дополнение к указанному источнику углерода. Такая концентрация неорганического фосфата в среде превьпдает в несколько десятков раз концепт. рацию в обычной бактериальной культуре и является совергпенно специфической. Если концентрация неорганического фосфата(рассчитанная по числу Р 04),) в среде ниже4 г/л, то не происходит увеличения выработкиАТФ, при концентрации выше 35 г/л ростАТФ-продуцируюшей бактерии замедляется,что приводит к уменьшению выхода АТФ. Неорганический фосфат в высокой концентрации препятствует секретированию продуцированной АТФ бактериальными клетками и разру шению АТФ фосфотазой. Неорганические фосфаты, используемые в изобретении, принадлежат к соединениям, обычно применяемым при приготовлении ферментационной среды, и включают, например, (1 ЧН 4) НГ 04, КН, РО 4, и К НРО, . Состав, используемый для приготовления среды, может включать, кроме названных источника углерода и неорганического фосфата и неорганическую соль (соль калия, магния, железа, марганца и т. д.) и в некоторых случаях неорганическую соль металла, такого как цинк, кобальт, молибден и других, также как и источник азота (аамиак, соль аммония, мочевина, нитрат и т. д.) . Возможно также добавление поверхностно-активного вещества, антивспенивателя и других добавок.(11 Н 4) ЗО 4ООМд 8047 Н 20 0,5 - 5,0Ее 804 7 Н 20 005 05ОСаС 122 Н О . 0 - 0,2Мп 804 Н О 0 - 0,2Источйикуглерода 0,05 - 2 об,%Культивирование названных АТФ-продуцирующих бактерий в указанной среде предпочти-, тельно вьгполняют при следующих условиях: рН 5,8 - 9,0, предпочтительно 6,0 - 8,0, температура 15-50 С, предпочтительно 20 - 40 С, и уровеньо о аэрации 0,5 - 4,0 Ч,Ч.М (объем воздуха, л.обьем раствора куйьтурьс л/мин), перемешивание при 40 - 600 об/мин, в течение 2 - 9. дней. Для доведения рН среды культуры могут быть использованы щелочное вещество (аммиак), кислое вещество (серная кислота), буферный агент (фосфатный буфер) или другие пригодные вещества, такие как мочевина, углекислый кальций и т. д. В случае использования щелочного вещества наибольшее предпочтение отдается аммиакупоскольку он может служить источником азота, Если указанные бактерииЗО форментируют при указанных условиях культивирования согласно изобретению, АТФ накапливается в среде в высокой концентрации 2 - 12 г/л. После завершений ферментации микробы удаляют и продуцированную АТФ отделя. 35 ют и выделяют известным способом, Например, после удаления бактериальных клеток из ферментационной среды (бульон) супернагант подвергают комбинации фракционирования и концентрирования. осаждения путем адсорбции 40 и элюции с использованием активированного угля и анионообменной смолы, в результате чего происходит выделение продуцированной АТФСогласно изобретению АТФ продуцируется и накапливается в среде культуры в высокой 45 концентрации свыше 2 г/л без добавления в среду аденина или его дериватов.Количество продуцированной АТФ в случае каждом примере определяют путем использования принципа реакции между АТФ и люцифе риц-.люциферазой, который выражается следующим образом: ф1) Люиифериц+люцифераэа+АТФ - аденизлюциферин-пирофосфат;2) Аденил-люциферин .аденйл-оксилюци ферин.Интенсивность свечения флюоресцирующего продукта второй реакции в интервале длин волн 19 4560.-580 цм измеряют в течение данного периодавремени с использовас:чем СЕМ 61 09/РНОТОМЕТЕВ,4 - 714 с (Аггсегссао 1 пзггссспеп 1Со) и полученный результат соотносят с предварительно полученной калибровочной кривойстандартных растворов АТФ, в результате чегоопределяют количество АТФ в растворе культуры,П р и м е р 1. Основная среда готовитсярастворением 7,0 г (йН 4) НРО 4, 1,0 г КН РО1,0 г К 2 НРО 4, 1,0 г МдЯ 047 Н О,и 1,0 г804 7 Н с вл ионообмецссой водь100 мл этои основной среды отмеряют пипеткой в каждую из 300-миллилитровых Эрленмейе.ровских колб, после стерилизации в каждуюколбу добавляют 1,6 г метанола, В приготовленную такисс образом среду засевают Меггсу 1 остсопев ргоЬзз ЕЕВМ-Р - 3199, к,орый предварительно культивируютна скошенном агаре суказанным составом, после чего колбы встряохивают при 30 С. На 4-й день после засева сре.ды в растворе культуры продупировацо инакоплено 2,8 гл АТФ.1 л этого расгвуа культуры подвергаютнагреванию цри 80 С в течение 5 мцц,и после охлаж;гения ссесстрсфугироацию дляосаждения бактериальцых клеток, после чегосупсрцатацт, доведешсый до рН 3,5 3 н. соляной кислотой, обрабагыают активированньсмуглем для адсорбции АТФ и затем адсорбированную на акгивцрованцом угле АТФ элюируют 5 СГ 4-ньсм раствором алкоголя, содержащим1,4% аммиака. Это элюат коссс 1 рируют припониженном давсесс и при низкой температуре для удаления избытка аммиака, доводярН до 8,0,Затем коццсцтрирозццьсй растьор пропускают через колонку сильноосцовцой ациоцообмеццой смолы Оооех (ггасе спагс) 1 - Х 2(С 1 )которая предаритсльно доспеца до смолыС 1-тига, в результате чего ЛТФ адсорбируетсяна колонке. Адсорбат промывают иоцообменцой смолой и эгцоируют смесью соляной кислоты и хлористого натрс:я (0,2 М р, створ 1 аС 1,полученный растворением 0,2 М расгвора НС 1рН 1,7), в 1 аС 1) и ., фракцию АТФ отделяют,Этот элюат нейтрализуют слкцм цатром, пропускают через колонку. набитую активированцым углем, элюируют 15 Ч.сой аммиачной водойи получесшьсй элюат кошюцтрируют цри нагревании для отгонки аммиака. Путем добавленияметанола к этому концентрированномураствору получают 2,2 с крсссыссо цатрисвойсоли ЛТФ.П р и м е р 2. 20 л ср 1 сс, црисотовленнойрастворением 7,0 г (чН 4) 2 ПРО 4, 1,0 с КН РО1 0 с К 2 НЮ 4 2,0 с Ыд 804, 711 О сс0,2 Ее 804 7 НО и 0,2 мл асстиссссссссивателяК - 66 в 1 л ионообмеццой воды загружают в44619 6Ф1в среде увеличивают до 20 г/лЧерез 96 ч после начала культивирования в растворе культу.ры лродуцируетсяи накапливается 12 г/л АТФ,которую выделяют по примеру 1.5 П р и м е р 4. Повторяют процесскульти-вирования по примеру 2, однако используют30 г/л (гс 1 Н 4)НРО 4 для приготовления среды.Через 96 ч после начала культивированияпродуцируется и накапливается 7 г/л АТФ,которую выделяют по примеру 1.Сравнительный пример 1,Культивирование проводят по примеру 2, однако количество (ЙН 4) НРО 4 в среде уменьшенопо 3 г/л. Через 96 ч йосле начала культивиро вания в растворе культуры продуцированотолько 0,2 г/л АТФ.Сравнительный пример 2.Культивирование проводят по номеру 2, однакоколичество (1 чН 4) НРО 4 увеличено до 50 г/л, 20 Через 96 ч после начала культивирования врастворе культуры .продуцировано только1 г/л АТФ.П р и м е р 5. Культивирование проводятпо примеру 3, с использованием штаммов 25 указанных в таблице Штамм Выход АТФ, г/л МетЬу 1 огпопаа гпетЬу 1 осгога АТСС 21369 3,5 Раеос 1 огпопа паоета АТСС 21265 АТСС 21704 3,1 Раеисогпопаа гпетЬапо 11 са 3,6 Раеосогпопаа петЬапса АТСС 21439 3,2 ЛТСС 8457 РгосагппоЬастег гцЬег АТСС 21372 АТСС 21232 АТСС 14579 2,5 РготагппоЬастег сапс 1 соа СогупоЬастеггогп ар. 2,3 Вас 11 сса сегда 2,2 АсЬгогпоЬастег гпеСЬапо 1 орЬ 1 а АТСС 2175 П р и м е р 6. МетЬу 1 огпопаа ргоЬоа РЕЯМ РЕЯМ - Р - 3193 культивируют ло примеру 2, однако в качестве компонента питательной50 среды вместо метанола испольэуют метиламин, После культивирования микроорганизмовв течение 20 ч 4,5 г/л аденоэин - 5 трифосфата получено и накоплено в культурной среде,ВНИИПИ Заказ 956/46 Филиал П 1 П "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, 4 30 литров гй сосуд-ферментер и стерилизуют при 120 С давлении 1,2 кг/см в течениег30 мин. После охлаждения к указанной среде добавляют 200 мл метанола, и среду засевают 2%-ной кульгурой (МетЬу 1 огпопаа ргоЬсгаРЕЯМ - Р - 3193), которая культивирована на укаэанной средес последукщей аэрацией на уровне 20 л/20 л (жидкое количество)/мин (0,5 Ч.Ч.М ) при псрсмсшнвании со скоростью 500 об/мин при 35 С. Уровень аэрации повы. шают до 20 л/20 л /мин (1,0 Ч.Ч,М.) с ростом бактерий, и культивирование продолжают в течение 96 ч рН срсдьг автоматически контролиру. ют в пределах 6,0 - 7,2 с помощью аммиачной воды в течение культивирования, в то же время потребление метанола измеряют газохроматогра. фически, при.этом устанавливают автоматическую подачу метанола с тем, чтобы его концентрация постоянно находилась на уровне 0,3 - 2,0%. Через 96 ч после начала культивирования в растворе культуры продуцируется и накапливается 5,3 г/л АТФ, которую выделяютпо примеру 1,П р и м е р 3. Культивирование проводят по примеру 2, однако количество (чН 4) НРО 4 накопленный таким образом.аденоэин.5.трифосфат отделяют и изолируют по примеру 1.Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает получение целевого продукта безиспользования аденина или его производных,что снижает себестоимость аденоэин.5 -трифос.