Способ изоэлектрического фокусирования белков

(19) (И) СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСЙУБЛИК щ 6 01 )ч 33/5 СУДАРСТВЕНН ОМИТЕТ ССС Бкп. М 13кий, Г. В, Троицкий едицииский институт88.8)для биохимии и кли Стокз ольм, изд-вои) апд Т)усМ АВ", 19 2, Ажицкий Г.Изоэлектрическое фаФвенном градиенте., Троицкий Г, В.кусирование и искусрН. - в кн.: Элекоды анализа белков, СССР, Новосибирск,: (54) (57) СПОСОБ ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОГОФОКУСИРОВАНИЯ БЕЛКОВ, включакецийсоздание устойчивого градиента рН внесением раствора сахарозы в трис-боратный буфер в изоэлектрической колонке,о т л и ч а ю ш и й с я тем, что, сцелью возможности фракционированиябелков с изоэлектрическнмн точками вдиапазоне рН 9,3-12,0, градиент рНсоздают путем многократного последовательного внесения в колонку растворасахарозы, при первоначальной концентрации сахарозы 64-65 % с последуюшим уменьшением ее на 3-4 % прикаждом внесении, при этом используют0,001-0,0015 М трис-боратный буфер,содержаший 0,007 0,0075 М едкогонатра.10 5 20 25 30 35 40 45 50 Способ осуществляют следующим образом,Гиговят два раствора, Первый (А) состоит из 0,00125 М (0,001055 Изобретение относится к биохимии и биофизике, в частности к способам электрофореза белков в искусственных градиентах рН.Известен способ изоэлектрического фокусирования белков путем создания устойчивого градиента рН с помощью буферного раствора . - амфолина. Этот раствор состоит из веществ пептидной природы (более 1000 компонентов) с различной величиной Э, Будучи внесенными в электрическое поле, амфолины двигаются к аноду и катоду и тааим образом создакп градиент рН в диапазоне 9-11 1Недостатком этого способа являетсяй невозможность получения градиентов рН более 11. Это препятствует фракционированию крайне. щелочных белков, таких как гистоны, цитохромы; и ферментов, например липогеназы.Наиболее бпизким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту является способ изоэлектрического фокусирования белков, включающий создание устойчивого градивнта рН внесением раствора сахарозы в трио-боратный буфер в изоэлектрической колонке 2Однако известным способом возможно получать градиент рН в трис-боратном буфере (рН 8,5) только в интервале 4,5-8,5, что не позволяет фракционировать белки и ферменты, имеющие изоэлектрические точки (3 ) в диапазоне рН 8,5 - 12.Бель изобретения - возможность фрак- . ционирования белков с изоэлектрическими точками в диапазоне рН 9,3-12,0,Поставленная цель достигается тем, что согласно способу изоэлектрического фокусирования белков, включающему создание устойчивого градиента рН внесением раствора сахарозы в трис-боратный буфер в изоэлектрической колонке, градиент рН создают путем многократного последовательного внесения в колонку раствора сахарозы, при первоначальной концентрации свхарозы 64-65% с после дующим уменьшением ее на 3-4% при каждом внесении, при этом используют 0,0015 М 015 М трис-боратный буфер, содержащий 0,007-0,0075 М едкого патра. 0,0015) М буры; 0,00125 М(В) состоит из раствора А, в которойдоплнительно вносят сахарозу до концентрации 64,5% (64-65%), и для полученияградиента рН растворы А и В смешивают, т.е. понижают концентрацию сахаро-. зы до необходимой. Далее порции раствора (смесь А и В) вносят в изоэлектрофокусируюшую колонку, куда помешают анализируемую пробу белка. Верхний и нижний электролитные сосуды заполняют раствором А и подключая электрическийток проводят изоэлектрическое г фракционирование белка..П р и м е р . Готовят раствор, содержащий 0,00125, М буры, 0,00125 М триса и 0,00725 М едкого патра, а также раствор, содержащий все перечисленные компоненты в той же концентрации и дополнительно 64,5% сахарозы. Для получения градиента рН в интервале 9,3-12,0 в 20-ти пробирках смешивают трис-боратный буфер с тем же буфером, содержащим 64,5 % сахарозы, причем смешивают в такой пропорции, чтобы концентрация сахарозы в каждой последующей пробирке уменьшалась на 3,0% в интервале концентрации саха- розы 64,5% - 0,5%. Затем в иэофокусирующую колонку вносят 2,5 мл трисборатного буфера с сахарозой из первой пробирки, т.е, с концентрацией сахароэы 64,5%, затем по 2,5 мл из каждой последующей пробирки: 2-ой, 3-ей и т.д. до 15-ой, после чего вносят 2,5 мл цитохрома С, растворенного в 16-ой порцииградиента рН и по 2,5 мп 17-ой, 18-ой,19-ой и 20-ой порции. Верхний и нижний электродныесосуды заполняют буферным раствором А, состав которого: 0,00125 М буры,. 0,00125 М трисаи 0,00725 М едкого натра.Концентрация сахарозы и рН в каждой порции градиента приведены в таблице (стабильный градиент рН в диапазоне рН 9,3 - 12,0).Условия опыта: напряжение 1250 В, 21 В/см, ток 4,5 мА, Время фокусирования 21,5 ч. После проведения изофокусирования содержимое колонки элюируется через проточный денситометр РЭППСМ на автоматический коллектор. Измерение рН, проведенное в каждой пробе, покаэывает, что градиент рН практически неискажается за время изофокусирования,и находится в пределах рН 9,25-9,350 11,5-12,5. При анализе распределения белка получено, что изоэлектрический спектр цитохрома С состоит иэ трех ковшонентов с иэоточками 10,5 (основной компонент) 9,8-9,9 и 11,1-11,2 (минорные компоненты),Таким образом, предлагаемый способ,5 1,80-1 20 11,95-12,05 0-1. 0 ъ871 Подписное ИИПИ Заказ 2482/35 Т ППП "Патент", г. фи од, ул, Проектная 1 10563 4ет расширение градиента рН до 12,0, ,позволяет производить иэофокусированиебелков в диапазоне 9,3-12,0, который ранее не был доступен. Это дает воэ% можность производить высокоэффективноефракционирование и очистку уже известных белков, изоточки ксгорых находят ся в этом диапазоне, а также осешусъ вить поиск не известных ранее белков.