Способ количественного определения фактора в плазме крови

/4 511 Ь 01 ОСУААРСТВЕННЬ 9ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕ ТЕТ СССРИ ОТКРЫТИЙ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ВИДЕТЕ У АВТОРСКО ов и(21) 3331993/28-13(71) Тюменский государственный меццинский институт"Кеч,йева 1 о 1, 1952, % 7, р. 1472. Баркаган 3, С. Исследование ситемы гемосгаза в клинике, Барнаул,1975, с. 134.-135,(54) (57) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАКТОРА Х В ПЛАЗМЕ КРОВИ, включающий получениесубсгратной плазмы, смешивание ее снормальной разведенной плазмой, внес ние в полученную смесь активатора свертывания и опрецеление протромбиновоговременисмеси, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения сохранности нагивных свойств плазмы,а также удешевления способа, получениесубстратной плазмы осуществляют путемвнесения в цитратную смешанную человеческую плазму слабоосновного анионообменного декстранового геля, соцержащего диэтиламиноэтильные функциональныегруппы с преимущественным ионным обменом для белков с мол. мас. 30000200000 дальтон при ионной силе 0,25 Мосажцение геля осуществляют огсгаива:кием, далее отбирают надосацочную субстратную плазму, а в качестве активатора свертывания используют тромбопластинкальциевую смесь.10 20 25 30 40 4555 50 Изобретение относится к медицине, вчасгносги к способам опреаеления факторов свертывания крови., Известен способ определения факторов Х и УП, преаусматриваюший получение субстратной плазмы, развеаениенормальной плазмы, смешивание их, опреаеление нротромбинового времени сме-си 1 .К неаостагкам способа относится нарушение нагивных свойств плазмы.Наиболее близким к преалагаемомупо технической сущности и достигаемому эффекту является способ количесгвенного определения фактора Х, преаусмаьриваюший получение субстратноЦплазмы, смешивание ее с нормальной раэвеаеннойплазмой, внесение в полученную смесь активатора свертывания И опреаеление протромбинового времени смеси.Согласно этому способу получают субсграгную плазму (уцаление иэ нормальной человеческой плазмы факто ров Х и УП) путем фильтрования через асбестовый фильтр ,раэвоаят нормальную смешанную (смесь равных объемов плазмы 5-10 заоровых люаей) человеческую плазму буфером Михаэлиса (ряа разве,аений от 1:10 ао 1:1000); смешивают равные объемы (по 0,1 мл) субстратной и нормальной разведенной плазмы с послеауюшим опрецелением протромбинового времени этой смеси; строят калибровочную кривую на основе данных, полученных при определении протромбинового времени всех приготовленных развеаений нормальной плазмы, опреаеляют протромбиновое время при смешивании исслеауемой (развеаенной 1:10),плазмы с субсгратной; содержание факторов УП и Х (%) в исследуемой плазме устанав диваюг с помощью калибровочной кривой.В качестве активатора свертывания используют змеиный яа 2. К неаосгаткам известного способа относится то, .что фильтрование плазмы через асбестс целью удаления фактора Х попутно привоаит и к удалению фактора УП; условия фильтрования привоаят к нарушению нативных свойств плазмы; использование в качестве активатора свертывания змеиного яаа заметно ограничивает аоступность способа и обуславливает его дороговизну; отсутствие в субстратной плазме фактора УП и нарушение нативных свойств плазмы при фильтровании через асбест снижает качество , опреаелений. Цель изобретения - повышение сохранности нагивных свойств плазмы, а также уаешевление способа.Поставленная цель аосгигается тем, что, согласно способу количественного опреаедения фактора Х вплазме крови, включающему получение субстратной плазмы, смешивание ее с нормальнойФ разведенной плазмой, внесение в полученную смесь активатора свертывания и опре деление протромбинового времени смеси,получение субстратной плазмы осушесгвляюг путем внесения в цитратную смешанную человеческую плазму слабоосновногоанионообменного аекстранового геля, соцержащего аиэтиламиноэтильные функциональные группы с преимущественнымионным обменом аля белковс мол. мас, 30000-200000 дальтон при ионной силе 0,25 М, осажаение геля осушествляют отстаиванием, цалее отбирают нааосааочную субстратную плазму, а в качестве активатора свертывания используют тромбопластин-кальциевую смесь. Приме р 1,К 50 млнормал ной смешанной циграгной плазмы человека (по 1 мл от донора) аобавляют 5,0 мл 0,36 М раствора хлориаа натрия. В.полученную смесь вносят 5,0 мл геля ЮЭАЭс:ефааекса А 50, предварительно набухшего в 0,25 М растворе хлориаа натрия. После осторожного помешивания З 5 в течение 0,5 ч и осажаения гранулгеля пипеткой отбирают плазму. Полученная плазма при рекальцифицировании не свертывалась в течение 1 ч. Эту плазму используют в качестве субсграгной. 0,1 мл нормальной смешанной чедовеческой плазмы, а также разведенную плаз му (1:1, 1:2, 1:4 и 1;8), смешивают с 0,1 мл субстратной плазмы, После инкубации на воаяной бане при 37 С (15 с) опреаедяют тромбопластиновое время смеси. Для разных раэвеаений плазмы оно блеаующее, с:Цельная + 0,1 млсубстратнойплазмы 127+4,7Разведеннаяя 1:1+0,1 мл - 166+5,41;2 Ю,1 мл -"- 213+7,61:4+0,1 мл "- 285+10,61:8 Ю,1 мл " 349+12,3 На основании цривеаенных, данных строят калибровочную кривую (график зависимости соаержания фактора Х в смешанной нормальной плазме ог времени свер3 1010 тывания субстрагной плазмы). За 100% принято время свертывания, установленное при смешивании цельной нормальной плазмы с.равным количеством субсгратной, 5.П р и м е р 2 . К 25 мл нормад ной смешанной циграгной плазмы человека добавляют 25 мл 0,36 М раствора хлорида натрия (ддя достижения в плазме итогового значения ионной силы ОД%в), 10 В полученную смесь вносят 25 мл геля ДЭАЭ - сефадекса А 50, предварительно набухшего в 0,25 М растворе хлорица натрия. Смесь осторожно помешиваюг, в течение 05 ч, после чего цают осесгь И гранулам сефадекса. Надосацочную плазму отбирают пипеткой и используют в качестве субстратной (лишенной фактора Х). Полученная плазма при рекальцификации не свертывалась в течение 60 мин. 2 ф Внесение извне гомогенного препарата фактора Х сокращает время свергывания при рекальцификации цо 33-35 с, что свидегельствуег об отсутствии в полученной плазме фактора Х. В качестве 25 контроля для построения калибровочной кривой используют смешанную человеческую плазму, развеценную 0,14 М раствором хлорида натрия (разведения: цельная, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16). зО В пробирку, установленную на воцяной бане, при 37 С вносят 0,1 мл суб 562 4стратной плазмы и 0,1 мл нормальнойсмешанной плазмы, После инкубации(15 с) вносят в пробирку тромбопластин-кальциевую смесь и фиксируют время свертывания. В полулогарифмическоммасштабе построят кривую разведенияпо зависимости тромбоплас типовоговремени от разведений нормальной стандартной плазмы. Время свертываниянеразведеннойплазмы принимают эа 100%,Пользуясь этой кривой, определяют содержание фактора Х в исследуемых образцах плазмы,При использовании предлагаемогоФспособа для определения содержанияфактора Х в плазме здоровых людей(50 цоноров) обнаружены инцивидуальные колебания:ог 87 цо 105%.Таким образом, прецлагаемый способпо сравнению с известным позволяетуменьшить время свергывания плазмыс 168 цо 125 с, что свицегельсгвуето большей чувствительности пригоговленной йо предлагаемому способу плазмык действию фактора Х; при размораживанин субсграгной плазмы уменьшитьвремя свертывания ее в присутствиифактора Х и громбопласгин-,кальциевойсмеси с 206-235 цо 134-143 с чтоуказывает на высокую сохранность .нагивных свойств плазмы, и снизить стоимость оцного опрецеления в 3;5 раза.Сосгавигель С. КаспаровРецакгор Л, филь. Техрец Т,Маточка Коррекгор И. БуллаЗаказ 2482/35 Тираж 871 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по. целам изобрегений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., ц, 4/5 филиал ППП "Пагенг", г. Ужгород, ул. Проектная, 4