Способ определения активности малатдегидрогеназы в биологических тканях

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(23) Приоритет 6 01 И 33/48 Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий.082(088.8) Опубликовано 23.05.82 Бюллетень М 9 19 Дата опубликования описания 23.05. 82(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЯХ Изобретение относится к медицине, а именно к способам изучения энерге тического обмена в тканях животных и человека.Известен способ определения малатдегидрогеназы в биологических тканях, включающий инкубацию гомогената ис-. следуемой ткани в буферном растворе с субстратом, внесение в инкубационную смесь кофермента и спектрофотометрию полученной смеси 1).Однако известный способ имеет недостаточную чувствительность и не- специфичен, вследствие того, что запуск реакции коферментом приводит к активации многих других НАДФ-зависимых дегидрогеназ.Цель изобретения - повышение чувствительности и специфичности способа.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения малатдегидрогеназы в биологических тканях, включающего инкубацию гомогената исследуемой ткани в буферном растворе с субстратом, внесение в инкубационную смесь кофермента и спектрофотометрию полученной смеси, кофермент вносят непосредственно в раствор гомогената, выдерживают в течение 5-60 мин в физиологическом режиме,далее добавляют субстрат.Способ осуществляется следующим 5 образом.После забора ткани хранят и гокогенизируют на холоду в 0,05 М трисбуфере в соотношении 1:20. Инкубационная смесь состоит, мл: 0,05 М 10 трис-буфер рн=7,4 2,5; МпСс 0,03 м 0,1;НАДФ 0,1 (3 мг в мл), гомогенат0,2.Общий объем 3 мл.Предварительную инкубацию проб(после встряхивания) проводят в течение 5-60 мин при 37 С. Реакциюзапускают добавление О,ЗЗМ субстрата 0,25 натрия яблочнокислого. Активность определяют по разности экстинкции на первой-тридцатой-шестидесятой минуте и выражают в наномолях на 1 г ткани за 1 ч. П р и м е р 1Печень гомогенизируют на холоду в 0,05 М трис-буфере в соотношении 1:20. Затем проводят преинкубацию при 37 С в течение 5 мин в инкубационной смеси следующего состава, мл: 0,05 М трис-буфер рн= 7,4-2,5; О,ОЗМ МпСс 0,1; НАДФН (3 мг в мл) 0,1; гомогенат 0,2.3 Заказ 3456/55 Тираж 883 Подпи си ое ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП "Патент", г. ужгород, ул. Проектная, 4 Обший объем пробы - 3 мп.Реакцию запускают добавлением 0,33 мп субстрата натрия яблочного,25 мп, Активность определяют по разности экстинкций на 0-30-60 мин и выражают в наномолях на 1 г ткани за 1 ч. Подсчет активности Фермента, проводился по следуюшей ФорАЕ 3,муле: А= К, гцеЬЕ - разность экстенкций, 3 - объем кюветы, ккоэффициент молярной экстинции НАДФН п . разведение ткани.П р и м е р 2. Деснаи слюнные железы (околоушная и прдчелюстная) гомогениэируют на холоду в 0,05 И 15 трис-буфере в соотношении 1:20За- тем проводят преинкубацию при 37 оС в течение 30 мин в инкубационной смеси. Состав смеси и остальное аналогично привару 1. Активность ма лой дегидрогеназы в этих тканях и 25-45 нмоль/г/ч.П р и м е р 3. Выделенные альвеолярный отросток и ребро гомогенизируют на холоду в 0,05 М трисбуфере в соотношении 1:20. Затем проводят .преиикубацию при 37 оС в течение 60 мин в инкубационной смеси. Состав смеси и остальное аналогично примеру 1, Активность малатдегидрогеназы5,5 и 55 нмоль/г/ч.Предлагаемяй способ обладает высокой чувствительностью, и специфичностью, что позволяет применять его для определения активности малатдегидрогеназы во всех тканях,Формула изобретенияСпособ определения малатдегидро-.геназы в биологических тканях, включающий инкубацию гомогената исследуемой ткани в буферном растворе ссубстратом, внесение в инкубационную смесь кофермента и. спектрофотометрию полученной смеси, о т л ич а ю ш и й с я тем, что, с цепьюповиаения чувствительности и специфичности способа, кофермент вносятнепосредственно в раствор гомогената,выдерживают в течение 5-60 мин в ФизиоЛогическом режиме, далее добавляют субстрат.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, Степанова Н.Г. НАДФ-ферментыв нормальной сердечной мыдце и приэкспериментальном миокардите,Вопросы мед.хим., 1969, 9 15,с. 346-351.