Способ получения антигена

ОРИК И Е ИЗОБЬЕТЕ ИЯ Союз СоветскихСоцнапнстнческннРеспублнк)М. Кд. А 61 К 39/02 рисое ением заявки,че -сударстеенньгн квапе СССР но делам наюбретеннй к открмтнй(72) Авторы изобретен Владивостокский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии 1 Заявител Б ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА 54) г кстракции реждаемостуберкулезом зобретения является пол юшего специфической ак ной пробы и показателя рофилов у больных псев ние активностью Цельюна, обл оврежда.отуберку. тесте ко емости лезом. Это дости елени тся тем, что для вьи используют осадок диализу, концентрируомасст и уда левого продук подвергают его Изобретение относится к области медиименно получению диагностических преп Известен способ получения антигена путем выращивания культуры бактерий псевдотуберкулеза на питательной среде с последуюшей последовательной экстракцией полученной биомас. сы раствором хлористого натрия и мочевины, осаждением ее и выделением целевого продукта 1.Однако такой способ не обеспечивает получения антигена, обладаюшего специфической ак. тивностью в тесте кожной пробы, и показателя пов и нейтрофилов у больных псев. дот ляют иэ него токсические липидные компонен Способ осуществляют следующим образом.Выращивают возбудитель псевдотуберкулезао на мясопептонном агаре при температуре 12-14 С в течение 48 час. Смывают культуры и отмьгвают от возможных примесей среды физиологическим раствором (центрифутирование при 3000 об/мин З.кратно в течение 30 мин. После этого обезвоживают бактериальную массу ацетоном, охлаж. денньгм до - 20 С, Экстрагируют 2,5%-ным раст. вором хлористого натрия, супертанат отбрасывают. Отделяют осадок центрифугированием при 4000 об/мин в течение 30 мин. Экстрагируют осадок 2,5 М раствором мочевины, супертанат можно использовать для приготовления диагностикума. Затем проводят диализ водонераствори. мого бактериального остатка. Лиофилизируют массу, экстрагируют токсический липидный компонент из водонерастворимого остатка по мето. ду Фолча (хлороформ. метанол 2:1 об/об. Высу. шивают препарат лиофилизацией или струей холодного воздуха.:Тираж 672 ЦНИИПИ Заказ 5588/6 Филиал ППП Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Затем приготавливают рабочий раствор ал.лергена на эабуферном растворе и фасуют аллерген по ампулам.Стерилизацию проводят текучим паром в автоклаве при 110 С в течение 20 мин.5Проверяют препарат на стерильность следующим образом,Содержимое ампулы высевают на три кося.ка мяса - пептонного бульона. Пробирки помещают в термостат при температуре 37 С, в течение 5-7 дней пророста сред не наблюдали. Затем проверяют препарат на безвредность.Для этого белым мышам (3 - 5 штук) весом14 - 16 г вводят пять кожных доз (0,5 мл) внут.)5рибрюшинно или подкожно. Срок наблюденияэа животными трое суток. Падежа животных неотмечали,Постановку реакции повреждаемости ней-.трофилов проводят следующим образом,20Берут две стерильные пробирки - одну контрольную, другую опытную. Антиген разводят5%-ным раствором цитрата натрия в концентрации 1250 мкм в 1 мл.Разведенный антиген разливают по 0,02 млна дно опытной пробирки. В контрольную наливают 0,02 мл 5%-ного цитрата натрия беэ антигена.Кровь у больных берут из пальца; 0,08 мл30помещают в контрольную пробирку и столькоже в опытную. В пробирке легко встряхиваюти ставят в термостат на два часа.По истечению этого срока содержимое пробирок вновь легко встряхивают, готовят мазки,35подсушивают их на воздухе, фиксируют в смеси с растворами аэотнокислого кальция и азотиокислой меди и формалина в течение 40 мин,Проводят через три порции 96 этилового спирта по 10 мин в каждой, подсушивают на возду.хо и окрашивают дистохимической реакциейна гликоген.Инокуляцию мазка проводят в течение 2030 мин. при комнатной температуре в растворепериодата калия.Промывают дистиллированной водой, затем.погружают на 20 - 25 мин вреактив Шиффа иобрабатывают в сернистой воде в течение 10 -15 мии. Отмывают в дистиллированной воде (10 -15 мин). Препарат обрабатывают в растворегематоксилина в течение 2 - 10 мин,В препаратах (контрольный и опытный) считают по 100 нейтрофилов, классифицируя их на нормальные иповрежденные . Результаты подсчета обрабатывали по формулеНо -Нк. 100где Но - число поврежденных нейтрофилов вопыте;Нк - число поврежденных нейтрофиловв контроле;100 - количество просмотренных в мазкеклеток,При просмотре препаратов от 50 больныхдальневосточной скарлатиноподобной лихорадкой показатель повреждаемости нейтрофилов (ППН) составил 0,21 - 0,3 + 0,02, Реакции, проведенные в качестве контроля специфичности с группой практически здоровых людей, дали показатель повреждаемости нейтрофилов равный 0,01 - 0,001. Постановка определения покаэателя повреждаемости нейтрофилов с указанным алегреном и кровью больных другими инфек. ционными заболеваниями (брюшной тиф, дизентерия, болезнь Боткина, коревая краснуха, раз-личные виды ангины) дала средний показатель повреждаемости нейтрофилов 0,03 + 0,001, что свидетельствует о высокой специфичности пре. парата.Предлагаемый способ обеспечивает получение антигена, обладающего специфической активностью в тесте кожной пробь., и показателя повреждаемости нейтрофилов у больных псевдотуберкулеэом. Способ получения антигена путем выращивания культуры бактерий псевдотуберкулеэа напитательной среде с последующей последовательной экстракцией полученной биомассы растворомхлористого натрия и мочевины, осаждением ееи вьщелением целевого продукта, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью получения антигена, обладающего специфической активностьюв тесте кожной пробы, и показателя поврежда.еМости нейтрофилов у больных псевдотуберкулезом, для выделения целевого продукта исполь.зуют осадок биомассы, подвергают его диалиэу,концентрируют и удаляют из него токсическиелипицные компоненты путем экстракции.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Авторское свидетельство СССР Иф 529833,кл. А 61 К 39/02, опублик, 1976,