Способ получения 5-фосфодиэстеразы

) П тет Совета Министров СССоо делам изобретенийи открытий убликовано 30.07.77. Бюллетень28та опубликования описания 22.08.77(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 5-ФОСфОДИЭСТЕРАЗЪ 2 ризующие хо из моллюскпредставлены бл. 1, выход ученный в рез д выделения ов Рге 1 ззепа в табл. 1.составляет ультате очиИзобретение относится к получению биологически активных веществ, которые могут найти применение в медицине в качестве лечебных препаратов.Известен способ получения рибомононуклеотидов из нуклеиновых кислот путем гидролиза РНК 5-фосфодиэстеразой, полученной из экстрактов растений с последующим выделением целевого продукта ионообменной хроматографией.Известен также способ получения 5-фосфодиэстеразы путем экстракции растительного сырья в присутствии органического растворителя при рН 8.Однако известный способ не обеспечивает высокого выхода фермента.С целью повышения выхода фермента обработке подвергают гомогенаты тканей моллюсков вида Рге 1 ззепа или Аподоп 1 а и целевой продукт осаждают высаливанием при рН 3 с доведением рН до 5.П р и м е р 1. Получение ферментного препарата из моллюсков Эге 1 ззепа ро 1 угпогрйа Ра 1- 1 аз.Берут живых дрейссен и тщательно механически их измельчают. Из измельченной массы берут навеску в 500 г, добавляют 400 мл воды, подщелоченной КаОН до рН 8 (конечная рН гомогената равна 8). Полученную смесь выдерживают на холоде в течение 3 час, далее фильтруют. Осадок, содержащий балластные оелки отбрасывают, а фильтрат подкисляют концентрированной соляной кислотой до рН 3 и оставляют на холоде на 3 дня. Надосадоч ную жидкость удаляют декантированием, аосадок, содержащий активный фермент, растворяют в небольшом количестве воды (100 мл), рН которой равна 5 (подкисляют соляной кислотой). В процессе выделения 5- 0 фосфодиэстеразы из моллюсков его активность проверяют по расщеплению дрожжевой рибонуклеиновой кислоты. За единицу активности фермента принимают такое его количество, которое освобождает в процессе инкубации в данных условиях 1 мкг нуклеотидного фосфора. Инкубационная смесь для гидролиза дрожжевой РНК содержит 0,5 мл натрийацетатного буфера рН 5, 0,2 мл раствора РНК (из расчета 0,5 мг на пробу) и 0,3 мл тканево го экстракта (из расчета 1,5 мг на пробу). Инкубацию проводят при 37 С на водяной бане в течение 30 мин. Реакцию останавливают добавлением 0,01 М МдС 12 в 80 этаноле (где конечная концентрация 0,01 М МдС 1, в 50 5 этаноле) .Данные, хар актеУдельнаяактивность Этапы выделения Гомогенат 0,5 3,0415,0 14,5 1,5 1,5 93000 57000 56000 100 61,3 60 фильтрат после подщелачиванияОсадок после подкисления Таблица 2 Выделение препарата, обладающего 5-фосфодиэстеразной активностью,из моллюсков Апойоп 1 а аудпеаУдельная Выход ферактивность мента, о,Концентрациябелка, мг/мл Общая активностьЭтапы выделения 100 60 50 0,5 4,4611,05 93000 58000 52500 14,5 1,5 1,9 Гомогенат фильтрат после подщелачиванияОсадок после подкисления Формула изобретения Составитель С, Малютина Техред М. СеменовКорректор Л. Брахнииа Редактор М. Дмитриева Заказ 1886/10 Изд. Ме 647 Тираж 693 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5Типография, пр. Сапунова, 2 стки, обладающий достаточно высокой удельной активностью,П р и м нр 2. Получение ферментного препарата 5-фосфодиэстеразы из анодонты (Апойоп 1 а 5 удпеа).Вскрывают раковины и отделяют тело моллюска от них. 500 г биомассы гомогенизируют (на 500 г биомассы расходуют 4 л воды, подщелоченной в 1 н. МаОН рН 8. Полученную смесь выдерживают на холоде в течение 3 час. Затем фильтруют, осадок, содержащий балластные белки, отбрасывают, а фильтрат подПредлагаемый способ получения 5-фосфодиэстераз из моллюсков характеризуется простотой выделения целевого продукта, дешевизной, а сами 5-фосфодиэстеразы обладают более высокой ферментативной активностью. Полученный препарат 5-фосфодиэстеразы позволяет получать рибомононуклеотиды высокого качества. Себестоимость получения 5. фосфодиэстераз предлагаемым способом понижается на 15 - 25,кисляют до рН 3 концентрированной соляной кислотой и оставляют на холоде на 3 дня, Надосадочную жидкость удаляют, а осадок растворяют в 200 мл воды, рН которой равна 5.5 Полученный препарат используют как источник 5-фосфодиэстеразной активности,Данные, характеризующие ход выделенияпрепарата 5-фосфодиэстеразы из моллюсков Аподоп 1 а Будпеа, представлены в табл. 2, Вы ход целевого продукта из моллюсков составляет 50/а. 15 Способ получения 5-фосфодиэстеразы путем обработки исходного сырья с последую.- щим выделением целевого продукта, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода фермента, обработке подвергают гомогена ты тканей моллюсков вида Рге 1 ззепа илиАподоп 1 а и целевой продукт осаждают выса.ливанием при рН 3 с доведением рН до 5.