Способ диагностики кислородной недостаточности

111) 545335 Союа Советских Социалистических Республик(23) Приори Опубликован Дата опубли Государственный комитет Сова 1 а Министров СССР оо делам изобретений 5,02.77, Бюллетень5 анця описания 03.03.77Д, Г. Крыжановский и Е. Л, Эркес Днепропетровский ордена Трудового Красного Знамени медицинский институт4) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ КИСЛОРОД НЕДОСТАТОЧНОСТИчают из гепарц- ентрифугировамытых трижды Изобретение относится к биохимии и можетбыть использовано в клинической практике.Известен способ определения гипоксическихсостояний в реанимации, который заключается в том, что о степени гипоксии судят по изоферментам лактатдегидрогеназы 1.Однако известным способом не всегда возможно выявить начальные стадии кислородной недостаточности,Целью изобретения является выявление начальных стадий кислородной недостаточности.Эта цель достигается тем, что определяют вэритроцитах с помощью электрофореза дополнительную анодную фракцию изоферменталактатдсгцдрогеназы, расположенную меядулактатдегидрогеназой - 2 (ЛДГ 2) и лактатдегидрогеназой - 3 (ЛДГз), при содержаниикоторой свыше 4% от общей активности диагностируют раннюю стадию гипоксии,Исследование проводят в камере для электрофореза с применением охлаждения при использовании агарового носителя и мединалвероналового буфера (рН 8,6, ионная сила0,0 б) с подбором оптимальных концентрацийгемолизата эритроцитов, режима проведенияэлектрофореза и условий проведения энзимрсакции.Гемолизат эритроцитов полунированпой крови, лишенной ццисм плазмы, лейкоцитов и от охлажденным гепаринизированным физиологическим раствором (5 1." гепарина на 1 мл раствора) разведением дважды дистиллированной водой (1: 10) с последующим центри фугированпем (20 мцн при 3000 об/мин) дляосаждения стромы. Такое разведение обеспечивает достаточное количество белка-фермента для проведения электрофореза. Гемолизаты, полученные разведением 1: 3, 1: 5, дают 10 после окраски фореграмм более интенсивные,цо мсцсе четкие границы раздела фракций.Более разведенные гемолпты не обеспечивают выявлецпч катодных фракций, содеряание которых в эрцтроццтах низкое.15 Агаровьш гель готовят цз вымороженныхсортов агара (10 г) после предварительной очистки путем промывания вначале водопроводной водой (5 дцсй), затем воду сливают, заливают дистиллированной водой (500 мл) и 20 агар расплавляют, поместив колбу в водянуюбаню. Расплавленный агар в теплом виде фильтруют через ватно-марлевый фильтр, цснтрпфугируют прп 3000 об/мин до полного застывания. Е 1 цжнцй сегмент, содержащий 25 загрязненные вещества, отбрасывают. Измельченные (1 Р,1 см) кубики агара отмывают дистиллированной подои 3 - 5 дней. Воду меняют ежедневно. После чего агар повторно расплавляют, цснтрцфугцруют ц осадок вновь 30 отбрасывают. Агар сохраняют в холодильни545335 20 Формула изобретения Составитель С. Малютина Техред Б. РыбаковаКорректор Л. Орлова Редактор Л. Гончарова Заказ 242/3 Изд.407 Тираж 654 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений н открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Типография, пр. Сапунова, 2 ке. Перед опытом агар расплавляют на водяной бане и смешивают с равным объемом мединал-вероналового буфера (рН 8,6). После смешения буфера и агара концентрация агара 1%, ионная сила 0,06.Перед электрофорезом теплый раствор агарового геля наносят на 9 предметных стекол (26 К 76 мм), чтобы образовался слой геля толщиной 2 мм.Разделение изоферментов продолжается 3 - 3,5 ч при температуре 0 - 2 С, сила тока 55 - 60 мА, напряжение 90 В.После окончания электрофореза предметные стекла (9) со слоем агара переносят в кювету из органического стекла и поверх агарового носителя наливают приготовленную непосредственно перед инкубацией смесь.Состав инкубационной смеси; лактат натрия (0,2 М раствор 3,5 мл, рН 7,0); никотинамидадениндиноклеотид (НАД) (25 мг в 2 мл воды); нитросиний тетразолит (15 мг на 2 мл воды); цианистый натрий или цианистый калий (3 мл 0,05 М раствор в фосфатном буфере, рН 7,4); феназинметасульфат (2 мг на 2 мл воды); фосфатный буфер, рН 7,4 (50 мл), инкубация в этой смеси продолжается 120 - 140 мин при 37 С. После инкубации субстратную смесь сливают и электрофореграммы несколько раз промывают дистиллированной водой, фиксируют 2 ч в смеси: уксусная кислота; этиловый спирт; вода (5: 70: 25), Затем предметные стекла с агаровым гелем осторожно извлекают и агаровым слоем вниз кладут на тройной слой хроматографической бумаги. Через 12 - 16 ч из агарового геля образуется сухая пленка, плотно прилегающая к предметному стеклу.Активность изоферментов оценивают после денситометрии, либо фотометрии и расчета относительной активности в процентах. Наблюдениями группы больных в 27 чело.век с поражением бронхо-легочного аппарата в возрасте от 25 до 40 лет и контрольной группы в 25 человек в возрасте от 17 до 40 лет ус тановлено, что использование предлагаемогоспособа диагностики выявило у клинически здоровых лиц в возрасте от 17 до 40 лет дополнительную фракцию лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в количестве 3,30+0,33% от всей ак О тивности ЛДГ эритроцитов (Р 0,001),У больных уже в начальных стадиях кислородной недостаточности увеличение этой фракции достигает более 100 - 120%.Таким образом, увеличение содержания до полнительной анодной фракции изоферментаЛДГ, расположенной между ЛДГ и ЛДГз, позволяет судить о гипоксии в клинически скрытых формах дыхательной недостаточности,Способ диагностики кислородной недостаточности, заключающийся в определении ак тивности гликолитических ферментов, отлич а ю щи й с я тем, что, с целью выявления начальных стадий кислородной недостаточности, определяют в эритроцитах с помощью электрофореза дополнительную анодную фракцию 30 изофермента лактатдегидрогеназы, расположенную между лактатдегидрогеназой - 2 и лактатдегидрогеназой - 3, при содержании которой свыше 4% от общей активности диагностируют раннюю стадию гипоксии.35 Источник информации, принятый во внимание при экспертизе;1. Маркелов И. М, Оценка активности изоферментов в аспекте современных проблем реанимации. Афтореферат докторской диссер тации, Л., 1971, 3.