Способ количественного определения -метионина

ко-т ифт 3 Советскихалистицескихест 1 ублик ИЗОБРЕТ ТИЛЬ СТ К АВТОРСКОМ,о .) Дополнительно авт. свид.ву 22) Заявлено 28,03,75 (21) 2135257/13 1)М, Кл С 12 К С 12 Р 1/00 3/06 вки-Государственный комитет Совета Министров СССР по делам иэооретений и открытий12.76,Бюллетень3) УДК 66 3. 1 32: : 576.8,097 т,088,8) ия описания 28,02.77 Авторыизобретени С.В. Кажоя М анесян Чаренцаванский филиал Вс исследовательского зного) Заявител генетики и селекции промышленных микроорганизм инстит 54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ-МЕТИОНИНА биологик обласизобретение отеской промышленн не пригоден для опр солевых растворах, нделения метионина всмесях, например кулполученных после ферсодержащих, помимо к мик сится ти, а преде енн количественногот, в частности длления Ь -метио ения аминокис количественного оп на в питательных с ак -ж зотистые основанаким образом, эт для определения в культуральных жидк ии: во-вторых, в мут микробноеделения етионина, остях послных жидкост о - перв ферме ех и,втр нокисло чественного 1 Оуются тем,других ам утствиередь ри ть лина, ингибирующег в первую щью ауксотов в жидких биологичесзволяет вес обретения - более -метионина в сред ст Цржа н лин.тигается э х что по предлагаеиндикаторных мик - штамм Евс 1 тегсйа е редах. Наиве ка о ую тени момуий сп ба с тоит в следующ товку проб для од тионина61 Г 23Извепозволяе предел ения,Для этого пробы культуральных ей после ферментации отделяют цоб определения метионинанализ только в водных и 25 о рифу ги т вест с присоединением за (23) Г 1 рцоритет 43) Опубликовано 0, (45) Дата опублико Известны различные способь логического количественного оп аминокислот 111,Однако все эти способы кол анализа аминокислот характери что определение ведется с пом рофных мутантов микроорганизм средах. По этим способам микр кое определение аминокислот пти анализ только в синтетических и водных олее близким к описываемому изобпо технической сущности и достигаезультату является микробиологичесоб количественного определения мес использованием штамма Вастсомому способу в чоорганизмов исп лОГ 1 М-1.Технология спосСначала проводя сложных органическил ьтуральных жидкостях ментации аминокислот амих аминокислот, т ия, витамины и др. от способ не годится21 5380дрованием (30 мин 4000 об/мин) от микроорганизмов - продуцентов аминокислот, Надосадок разводят в минимальной среде в соотношении 1:5, инкубируют в кипящей водяной бане в течение 20 мин, затем проводят повторное центрифугирование (20 мин, 4000 об/мин),Полученный таким образом надосадок взависимости от ожидаемой концентрации ами нокислоты в пробах. разводят в 25, 125,625 и т.д, раз в минимальной среде М 9следующего состава;ЙН СГ - 1 г, Йа НРО - бг,42 4 УКН РО - 3 г, ЙаС 1 - 5 г, вода1000 мл.Во все разведения добавляют определенное количество суспензии индикаторногоштамма, Инкубируют в течение 24 час при ф37 оС,Определение мутности растворов проводят фотометрированием при помощи фотоэлек 2 Ь трокалориметра (кюветы - 5, 060, светофильтр6) с последующим определением концентрации метионина по стандартной кривой.Подготовка индикаторной культуры,Ауксотрофную по метионину культуру Е.соЕ инкубируют при 37 С стационарно в течение 18 час и переносят в минимальную среду М 9,содержащую добавки Ь -метионина (20 мкг/мл, где и выращивают до титра 1,0 - 5,010, В каждую пробирку с раз 9ведениями исследуемой жидкости добавляют определенное количество этой суспензии из расчета, чтобы конечный титр культуры получился 0,5 109.40 Построение стандартной кривой.В пробирки с разведениями в минимальной среде ферментационной среды, на которой проводилась ферментация микроорганизмов-продуцентов, добавляют различные концентрации метионина (100,50,25,20,10,5, 2,1 мкг/мл). Во все разведения добавляют определенное количество суспензии индикаторной культуры. Инкубируют в течение 24 50 час при 37 С, Определение мутности растворов проводят фотометрически на ФЭК (кюветы - 5, 060, светофильтр6), По средним значениям мутности строят стандартнуюкривую, характеризуюшую ответную реакциютест - культуры в зависимости от концентрации чистого метионина в среде.Характеристика индикаторного штамма.Индикаторный штамм Б со ауксотрофный по метионину, получен как производноеЕ. соус К 1 2 ( Ь ) (прототроф) под действием химического мутагена 1-метил-нитро-нитрозогуанидина, Было получено большоеколичество метиониннедостаточных мутантовЕ. саб мет ), которые сохраняют всесвойства, присущие исходному штаммуЕ сои, К 12 (), за исключением ауксотрофности по метионину,Среди большого числа Е. с 01 мет мутантов был отобран штамм, который лучшедругих отвечал требованиям, предъявляемымк тест-культуре: очень чувствителен к метионину (наблюдается рост культуры в присутствии метионина в концентрации 1 мгк/млсреды) и имеет низкую частоту оевер - 9сии 2,210Однако как и все штаммы Е.сОК, таки полученный мутант ингибируется валином,из-за чего он не пригоден для определенияметионина в присутствии валина. Поэтомуу штамма Е СОК, ауксотрофного по метионину, был получен валин-резистентныймутант, рост которого не подавляется в среде с валином, вследствие чего такой штаммпригоден цля определения метионина в культуральных жидкостях, содержащих валин. Формула изобретения Способ количественного определения Ь -метионина в питательных средах путем внесения в них индикаторных микроорганизмов, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с це 1 лью более точного определения и -метионина в средах, содержащих валин, в качестве индикаторных микроорганизмов используют штамм Е 5 сй Г и с Ма с о 11 М-1.Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:1, Рубан Б,Л. и Вербина Н,М, "Биосинтез аминокислот микроорганизмами", М., "Наука", 1968.2.Авт,св,134394, кл. С 12 К 1/00, 1959 (прототип).