О п и с а н и изобретения

Оюз СОвескмхСо цикад мсти мешихРеспуйпмк ОП ИКАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Зависимое от авт, свидетельства-М. Кл, 6 01 п 33,/16 Заявлено 191972 ( 1741193/28-13)с присоединением заявки-Приоритет -Опубликовано 22.Х.1973 Бюллетень44Дата опубликования описания 25,Ъ.974 государственный кемктетСената Министров СССРна делам кзоеетеккйк пткрыткй УДК 637.627 61088.8) Авторыизобретения Д. И. Погоняйло, Л. В. Богданов, Л. М. Погоняйло и И. С. Марцинкевич 3 аяв нтсл ь Белорусский научно-исследовательский институт животноводства СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ БЕЛКОВЫХ ФРАКЦИЙ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХИзвестен способ количественного определения содержания белковых фракций в биологических жидкостях, например молоке, включающий электрофорез, окрашивание электрофореграмм, отмывку их, элюирование связавшегося с белком красителя и определение экстинкпии элюпрованного красителя.звестпьш способ, предусматривает бумажный электрофорез с последующим элюированием связанной с протеином краски и определение экстинкции. Однако посредством бумажного электрофореза невозможно получить точное разделение белковых смесей на фракции.Предлагаемый способ повышает точность и значительно ускоряет разделение белковых смесей на фракции и количественное определение содержания протеина в электрофоретически различимых фракциях,Достигается это тем, что перед электрофорезом пробу, разделяют на две части и в одной из них осуществляют электрофорез на крахмальном геле, а в другой определяют содержание общего белка, например, методом Кьельдаля, после электрофореза гель разрезают на фракции и находящиеся против них контрольные участки такой ке площади, лишенные белка, при этом экстивкцию кусочков геля с отдельными фракциями определяют против элюата из соответствующего участка геля, лишенного белка, элюирование проводят насыщенным раствором мочевнны, а по экстинкции определяют соотношение белковых фракций с последующим пересчетом их процентного содержания на содержание белка в каждой фракции,Б Электрофореграмму окрашивают в насыщенном растворе амидового сине-черного красителя в жидкости, состоящей из метанола, уксусной кислоты и воды в соотношении 5:1:5.Для количественного определения белковых1 о фракций берут 50 г молока, в 1 О мл осуществляют электрофорез, а в оставшейся части определяют содержание общего белка и казеина по(ьельдалю. Пробу обезжиренного молока дляэлектрофореза подвергают разделению на вы 13 вороточные белки и казеины при изоэлектрической точке казеннов. Сыворотку отфильтровывают на бумажном фильтре, после,его казеинпромывают четыре раза водой, четыре разаэтанолом, два раза ацетоном и два раза этило 20 вым эфиром.Навеску казенна в количестве 20,иг растворяют внл буферного раствора, применяемогодля заварки геля,Разделение белков молока на фракции пройм водят методом горизонтального электрофорезав крахмальном геле с прерывистой системойбуферов.В качестве электролитного буфера использу;от раствор, состоящий нз 11,8 г борной кислозо ты и 2,1 г гпдрата окиси лития на 1 л электро40507 Предмет изобретения Составитель М. Ларина Редактор Л, Ксенофонтова Корректор Н, Аук Техред Л. Богданова Заказ 999 Изд. Ъо 1082 Тираж 755 По 1 пиено" 1 Л 1 П 11 П 11 Госудрствсииого ко)иитет(1 Совета Министров СССР ио дста)и изобретений и открытий Москва, Ж, Раушскви иаб., д. 4150(б)1. тии. ЬОс 1 )0)1 скГ ири взсии 51 и )д(1 тезьств, изиГрвфии и киики 011 ТОрГОв,1 н лита; в качестве гелевого буфера - раствор, содержащий 8, 67 г триги)дро)ксиметиламипометана и 1,5 г лимонной кислоты на 1 л геля, К)каждому литру гелевого буфера добавляют 190 мл электролитного, а затем мочевину до 5 6,6 М. К буферу с мочевиной перед заваркой добавляют 2-меркаптоэтанол из расчета 2 мл на 1 л. Гель готовят из 14,5 в взвеси частично гидролизованного крахмала,в буфере путем заварки на открытом пламени с последующим 10 удалением пузырьков воздуха под вакуумом.В пластину геля размером 13,5 р,2 Ор,0,6 см на кусочках фильтровальной бумаги размером 6(7 млю вносят по три образца нативного казеина и сыворотки от каждой пробы молока. 15После электрофореза гель разрезают с помощью устройства, обеспечивающего получение нижней чистой,пластины с равномерной по всей площади толщиной в 3 мм, Фо)реграл 1- му окрашивают в течение 15 лисн в насьпцен ном растворе амидового сине-черного красителя в жидкости, состоящей из метанола, уксусной кислоты и )воды в пропорции 5:1:5. Жидкость без красителя применяют для отмывки форег)рамм.25 Хорошо отмытые фореграммы обсушиваот фнльтровальной бумагой и разделяют по фракциям специально изготовленными пробойниками. На каждый образец сыворотки или казеи- З 0 на вьлрезают свой конт)рольный участок, свободный от белка. Таким образом, каждая фракция одной пробы представлена трижды, что значительно увеличивает точность способа,Кусочки геля помещают во флаконы объе мом 10 лл и наливают 5 мл насыщенного раствора мочевины, Элюирование продолжается 72 час, из них 48 час при комнатной темпе)ратуре и 24 час в термостате )при 37 С.Экстинкцию элюата оп 1 ределяют на спектро фотомепре при 625 нм проти)в контроля - элюата гелевой пластипк)и с фоном. Сумму показателей экстинкции по каждой пробе принимают за 100 Ов, показатель экстинкцин каждой 14фракции пересчитывают в процентах по отношению и сумме, Количество белка в сыворотке вычисляют по разности между общим белком и белком )казеина.Зная количество белка в цельном казеине и сыворот 5 ке, а также процентное соотношение содержания белка в сывороточных и казеиновых фракциях, рассчитывают содержание протеина во всех электрофоретически различимых фракциях молока. 1, Способ количественного определения содеркания белковых фракций в биологических жидкостях, например молоке, включающий электрофорез, окрашиванне элестрофореграмм, отмывку их, элюирование связавшегося с белком красителя и определение экстинкции элюированного красителя, отличающийся тем, что, с целью обеспечения возможности разделения белковых смесей на фракции и повышения точности определения, перед электрофэрезом пробу разделяют,на две части и в одной из них осуществляют электрофорез на крахмальном геле, а в другой определяют содержание общего белка, например, методом Кьельдаля, после эле 1 етрофореза гель разрезают на фракции и находящиеся против них такой же площади контрольные участки, лишенные белка, при этом экстинкцию кусочков геля с отдельными фракциями оп)ределяют 1 проти)в элюата из соответствующего контрольного участка геля, лишенного белка, элюирование проводят насыщенным раство)ром мочевины, а по экстин)кции спределяют соотношение белковых фракц)ий с последующим пересчетом их процентного содерканин па содержание белка в каждой фракции.2. Способ по и. 1, отличающийся тем, что электрофореграмму окрашивают в насыщенном растворе амидового сине-черного красителя в жид)кости, состоящей из метанола, уксусной кислоты и воды в соотношении 5:1:5,