Способ получения протеинов для изготовления диагностических биопрепаратов

Союз Советских Социалистических Республик,Ч. КЛ. А 6111 23/00 с присоединением заявкириоритет Комитет по дел зобретеиий и открытийпри Совете МинистровСССР Д 1 х 619:ст 6,8.09.34 (088.8) Опубликовано 28.Х 1.1972. Бюллетень5 за 1973 Дата опубликования описания 20.111.1973Авторытзобретения Г. Малахов, Г, И. Устинова и 3. С. Газарх Всесоюзный институт экспериментальной ветеринарии Всесоюзной ордена Ленина академии сельскохозяйственных наук имени В, И, ЛенинаЗаявител ОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕИНОВ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧ ЕСКИХ БИОПРЕПАРАТОВ)цслотой, а растворение дистиллированной водой Изобретение относится к области ветеринар. цой диагностики.Известен способ получения протеинов, вкл 1 очающий выращивание культуры, стерилизацию, получение фильтрата, осаждение активного протеина, растворение осадка, стерилизующую фильтрацию и лиофильцое высуш 1 вание. Однако он имеет ряд недостатков, например нестандартность, обусловленную различиями в смещении концентрации водородных ионов (рН) в культурах микобактерий в процессе их выращивания. Кроме того, этим способом протеицы из микобактерий экстрагируются непосредственно в питательную среду, в которой наряду с компонентами ее химического состава содержатся также продукты обмена и аутолиза микобактерий, от которых протеины освобождают, путем их многократного отмывания растворами кислот, солей фосфатов, этацолом, эфиром или ацетоном.Для получения протеинов в стандартных условиях непосредственно из бакмассы культуры по предлагаемому способу стерилизацию культур производят автоклавировацием после добавления раствора соляной кислоты, предпочтительно 2 н экстракци 1 О протеинов из отмытой от питательной среды бакмассы осуществляот дистиллировацной водой с рН 10,0, осаждецие протеинов из этих экстрактов проводят последовательным добавлением соляной ц трцхлоруксусцой кОСЯЛКЯ ОСУЦЕСТВЛ 5 ЦОТс р Н 7,0 - 7,2.Способ получения протеинов цз культур 5 всех известных мцкобактерцй туберкулеза, паратуберкулеза и кцслотоустойчцвых сапрофцтов лля изготовления диагностических биопрепаратов осущсствляется следующим оорязом.11 осев ц выращцвацце культур мцкобакте- О рий ця жидких цлц гвердых питательных срелах производят общепрццятымц сцосооамц.По окончании выращивания ца кажлый литр культ 5 1 эь мцкооя 1"тсрцй цлц смыва и 1 льтур вливают 20 11 л 2 и. раствора соляной кислоты, 5 автоклавцруют црц 120 в течение 30,11 ссн цохлаждают Ло коп ятцо 1 температуры.Охлаждеццьге культу)эь 1 фильтруют срез капроновое полотно, фильтр ат отбрасывают, я бакяссу проывс 1 От От Остят 1.Ов п 11 татель- О цой среды и соляной кислоты лцстцллцровяццой водой, подщелочеццой 0,1 и. раствором едкого патра ло рН 10,0. Отмывание бакмасс 1 проводят ло тех пор, пока в промывной воле це будет изменяться исходный р 11 10,0. Отмы тую бакмассу суспецдцруют в Лцстцллцровацной воде с рН 10,0 в ооъеме, равном /;, объема исходной культуры, автоклавцруют при 120" в тече 1 ьие 30 1 сссн, охлаждают до комнатной температуры п фильтруот последователь но вначале через капроновое полотно, а затем364321 Предмет изобретения Составитель В. Фогельман Редактор В, Фельдман Техред 3, Тараненко Корректоры: А, Николаева Л. КорогодЗаказ 497/4 Изд.151 Тирък 467 ПодписноеЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССРМосква, Ж, Раугиская наб., д. 4/5 Типография, пр. Сапунова, 2 через фильтр Зейтца с пластипами Ф или К. По окончании фильтрации бакмассу отбрасывают, а па каждый литр фильтрата для осаждеция протеинов добавляют 40 лгл 1 ц. раствора соляной кислоты, перемешивают, добавляют 40 л,г 40% раствора трихлоруксусцой кислоты, вновь перемешивают и смесь оставляют стоять 12 - 18 час при температуре 4 - 7 С.Осаждепие можно производить и только 1 ц. раствором соляной кислоты, цо для этого 41 еобходимо предварительно определить оптимальцое количество этого раствора, потребное для полного осаждеция протеинов. Для этого берут 10 пробирок. В каждую пробирку вливают по 10 юг фильтрата экстракта микобактерий и добавляют в первую 0,1 мл, во вторую - 0,2 ял, в третью - 0,3,я,г и так далее до 1,0 лл 1 и. раствора соляной кислоты, перемешивают и через 30 лин определяют в какой пробирке образовался наибольший осадок, Производят соответствующие пересчеты и полученное количество кислоты вливают для осаждения протеипов из всего ооъема фильтрата экстракта микобактерий, после чего смесь также оставляют стоять 12 - 18 час при температуре 4 - 7 С.В обоих случаях по окончании отстаивания цадосадочную жидкость отделяют сифоном и оторасывают, а осадок растворяют в дистиллировацной воде, подщелачеццой 0,1 и. раствором едкого патра до рН 7,0 - 7,2. Раствор осадка цецтрифугируют 30 иин при 3000 оборотах в 1 лин и в цем определяют количество белка. Его содержание должно быть равно 5 10 яг в 1 лчл раствора, Затем раствор фильтруют через фильтр Зейтца с пластинами СФ или ЕК, разливают по ампулам и сушат до замороженного состояния общеприцятым способом,10 Способ получения протеицов для изготовлеция диагностических биопрепаратов, вкл 1 о чающий выращивание культуры, стерилизацию, получение фильтрата, осаждецие активного протеина, растворение осадка, стериизующую фильтрацию и лиофильцое высушивацие, отличаои 1 ийся тем, что, с целью получеция 20 протеинов в стандартных условиях цепосредствеццо из бакмассы культуры, стерилизацию культур производят автоклавировацием после добавления раствора соляной кислоты, предпочтительно 2 ц., экстракцию протеинов цз 25 отмытой от питательной среды бакмассы осуществляют дистиллированной водой с рН 10,0, осаждецие протеинов из этих экстрактов проводят последовательным добавлением соляной и трихлоруксусцой кислот или одцой соляцой ЗО кислотой, а растворение осадка осуществляютдистиллированной водой с рН 7,0 - 7,2,