Способ получения “с-уридин-б-трифосфата

СОюз Соеетсиит Социалистичесиию Республии-4 Комитет по Приоритет иаобрвтеиий и отнрытийпри Соввтв Министров Л 963.3 26.118,0 (088.8) ублнковацо 20.Х 111972. Бюллетень3 за 1973 та опубликования описания 27,11.1973сср авторы1 зобретения Пумпец и Э. Я. Г И нститу анического синтеза АН Латвийской С явите ОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ С-УРИДИН-ТРИФОСФАТА бу получена новому спфосфата. биохнмич осится к сподов, именноС-ур иди нт-т применяется Изобретение от меченых нуклеотт собу получения т 4 Это соединение ских исследования Известен способ трифосфата путем лирования ттС-ур ко этот способ х мость и трудност дукта.полученияферментативдинт-монофрактеризуетсинтеза ис ридц -5 т- фосфорита. Однакая стоиого проюго осфа высо ходи среде с средней С целью упрощения процесса за счет применения более доступного исходного продукта предложено в качестве последнего использовать т 4 С-урацил, а в качестве катализатора - ферментпую фракцию бесклеточного экстракта ЕзсЬег 1 сЫа со 11 АВ 259 Н 1 г 3000. Процесс проводят в присутствии 0 - рибозы, аденозицт-трифосфата, ионов Мд+, а также системы, регенерирующей аденозинт-трифосфат, пируваткин азы и фосфоенолпирувата, при рН 7,7 - 7,9.Процесс протекает при 37 С в течение 4 час, Выход 14 С-уридинт-трифосфата (по урацилу) - 90 - 95%. Радиохимическая чистота полученного препарата - 95%.П р и м е р. Приготовление бесклеточных экстрактов Е, со 11 АВ 259 Н 1 г 3000,Клетки выращивают на пептоннойинтенсивной аэрацией при 37 С до логаршрмцческой фазы (7 - 8)(10 е клеток/,пл), осаждают в центрифуге, отмывают от среды буферным раствором (0,01 М трпсНС 1, рН 7,8; 0,005 М МдС 1 ). Бесклеточцые 5 экстракты готовят растираццем клеток состеклом при 1 - 2 С, разбавляют полученную массу двукратным объемом буфера (0,2 М трис-НС 1, рН 7,8; 0,05 М МоС 1), вносят дезоксирибонуклеазу (0,01 лг/лтл раствора), цент рифугируют 20 паин при 10000 об/,иин в низкоскоростной центрифуге. Надосадочцую жидкость подвергают ультрацентрифугированию при 100 000 д в течение 1 час. Полученные экстракты быстро заморажпвают и хранят 15 при - 20 С, Непосредственно перед внесениемв реакционную смесь бесклеточцые экстракты нагревают при 50 С (в водяной бане) 3 чин, образовавшийся осадок удаляют центрифугированием, надосадочцую жидкость использу ют в качестве ферментной фракции Е. со 11.Синтез 4 С-уридцц-трифосфата. Реакционную смесь, содержащую (в иклтоль/.ял): т 4 С-урацила - 1,8; Р-рибозы - 9,0; аденозиц 5 т-трифосфата - 1,5; фосфоенолпирувата - 25 10; трис-НС 1 - 100; МдС 12 - 25; пируваткицазы - 30 лткг; бесклеточцого экстракта - 0,14 лтл ца 1 лтл реакционной смеси (рН 7,8), инкубируют 4 час при 37 С (в водном термостате). По истечении 3,5 час инкубации до полнительно вносят (на 1 лтл смеси):"62835 Предмет изобретения Составитель М. МакаровТехред Т. Миронова Редактор Е, Гончар Корректоры: Л. Царькова и Л. Н о в ожил ова Заказ 88810 Изд,1 Х: 06 Тираж 404 Подписное ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР Москва, К-З 5, Раушская наб., д. 4/5Типография, пр. Сапунова, 2 31,5 л 1 кмоль аденозин-трифосфата, 10 л кмоль фосфоенолпирувата и 30 лкг пируваткиназы. Инкубацию прекращают, помещая смесь в кипящую водяную баню на 3 мин. Образовавшийся осадок удаляется в низкоскоростной центрифуге, а надосадочная жидкость (после концентрировании в ротационном испарителе при 32 С) наносится на бумагу Ч 15/10 ОЕзао на 1 см старта) для хроматографирования в системе изомасляная кислота - вода - ко 1 щ. гндроокись аммония (66:33:5) нисходящим способом в течение 20 час. Хроматограммы сушат в струе холодного воздуха (2 - 3 час), отмывают в нисходящем токе эфира при 3 - 4 С в течение суток, зоны т 4 С-уридин-трифосфата вырезают и элюируют водой, полученный раствор концентрируют в ротационном испарителе (32 С), замораживают и храпят при - 20 С. Выход конечного продукта (по урацилу) - 90 - 95%.Полученный 14 С-уридин-трифосфат анализируют хроматографическп в системах: 1) этанол - 1 М ацетат аммония - 0,1 М ЭДТЛ (75:29:1), восходящая, 18 час; 2) изомасляная кислота - вода - конц. гидроокись аммония (66:33:1,5), нисходящая, 18 час; а также электрофоретически (0,05 М цитратный буфер, рН 5,0; 150 см. 1,5 час). Подвижности (К; -- для хроматограмм, Е - для элек 4трофореграмм) полученного препарата в указанных случаях найдены аналогичными таковым для стандартных образцов уридинт-трифосфата (Кеапа 1, Венгрия), Радиохимическая 5 чистота препарата составляет 95%. Основныехарактеристики УФ-спектра получе 1 ьного препарата соответствуют характерным для урндип-трифосфата.График, где по оси абсцисс отложено время 10 реакции (в мин), а по оси ординат - проценттаС-урацила, превращенного в т 4 С-уридин- трифосфат, показывает, что при описанных условиях реакции уже за 3 час инкубации практически весь С-урацил превращается в 15 4 С-уридин-трифосфат. 20 Спосоо получения таС-уридин-трифосфатапутем ферментативпого синтеза, отличсцощаася тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве исходного продукта используют 4 С-урацил, в качестве катализатора применя ют ферментную фракцию бесклеточного экстракта Евс 11 ег 1 сЫа со 11 ЛВ 259 Н 1 г 3000, и процесс проводят в присутствии Р-рибозы, аденозип-трифосфата, ионов Мд+, пируваткиназы и фосфоеполппрувата при рН 7,7 - 7,9,