Способ получения амилолитических ферментных препаратов

Союа Советских ИЗОБРЕТЕН ИЯ К ПАТЕНТУ Зависимый от патентаМПК С 126 13/ Заявлено 27 Л,1868 ( 1244451/28-13)Приоритет 02.И.1967 ( 34867/1967, Япония) Комитет по делам изобретений и открцти при Севете Миииотров СССРУДК 577,154,22 (088.8) публиковано 22.Х 11,1970, Бюллетеньза 19 ата опубликования описания 16.11.1971Авторыизобрете Иностранцы уйуки Иокобаяши, Канаме Зугимото и Иошинори Зато(Япония) Иностранная фирма Гайашибара Коаявитель ПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АМИЛОЛИТИЧЕСКИ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВбульоном при 30 С):в форме воронки. ть (с бульоном при й, слабый осадок, на очень тонкая пленка колония бурая, блеик желатины (с о разжижается альная жидкос становится мутно ости образуется фельная среда: и влажная. Стол медлен Культу 30 С): поверхн Карт стящаяРазмер Палочки, ные, оди С): листи. ЗО Изобретение относится к ферментной промышленности и касается способа получения амилолитических ферментных препаратов,Известен способ получения амилолитлческих ферментных препаратов культивирова нием бактерий Рзепдогпопаз зассЬагорЫа, продуцирующих фермент, расщепляющий а,4-глюкозидную связь в крахмале.В соответствии с настоящим изобретением предложен способ получения препаратов изо амилазы, расщепляющей а,6-глюкозидные связи в крахмале.Способ характеризуется использованием нового штамма бактерий Рзец 4 оптопаз агпу 1 одегаптоза ЯВ, выделенного из природы, 15Ниже приведена биологическая характеристика штамма.Морфология. клеток 0,4 - 0,6 Х 1,2 - 4,5 мк. споры отсутствуют, жгутики поляр ночные. Грамотрица С тельный.Органические среды. Штрих на агар-агаре (с бульоном при 30 С): гладкая блестящая поверхность, клетки слегка желтоватые. Чашка с агаровой средой (с бульоном при 30 С); 25 колония круглая, сплошная, гладкая и блестящая поверхность, слегка приподнятая, слегка желтоватая, непрозрачная.Столбик агара (с бульоном при 30 нейный и хороший рост около поверхно Физиологические и биохимические признаки.Лакмусовое молоко: становится щелочным. Производство пигмента: водораствопимый пигмент не образуется, клетки становятся желтоватыми.Пооизводство аммиака: образуется,Сероводород: не образуется,1 Лндол: не образуется.Нитрат: не восстанавливается.Производство ацетилметплкарбинола: не обпазуется.Каталазная активность: положительная. Использование сахаров и получение из них кислот: в аэробных условиях из глюкозы, арабинозы, маннозьт и мальтозы образуется кислота, газа не образуется; фруктоза. галактоза, лактоза, целлобиоза, сахароза, трегалоза, салицип, а-метилглюкозид, декстрин и крахмал используются в аэробных условиях как источники углерода, кислота не образуется. ксплоза, рамноза, целлюлоза, декстрин и инулин не используются,290542 10 15 20 25 30 Предмет изобретения 40 45 С оста в итееь Г. Гол ев аРедактор М. В. Макарова Текред Л. В, Куклииа 1(орректор Т. А. Джамаикулова Изд.84 Заказ 207, 17 Тираж 480 ПодписноеЦНИИПИ Комитета ио дед". и" ре еиид и о-.к 11 ьг,из и 11 и Соседе Мипистрои СССРМосква 1 С.З 5, Рдуспскдп иаб., д. 4,5 Сдпуиовд, 2 Тпподрирпи, пр. Сорбит, маннит, инозит, глицерин не используются.Бензойная, а-оксибензойная, салициловая кислоты и другие ароматические соединения не используются.Соли аммония и нитраты как единственные источники азота не используются, требуются органические источники азота, такие как глутаминовая, аспарагиповая кислоты или белковый гидролизат.Оптимальная температура роста: 25 - 30 С. Не может расти при 3 С.Оптимальный рН роста: 6,5 - 7,5. Летальная температура: 70 С в течение 10 лин,Потребность в кислороде: аэробный, Способ получения амилолитических ферсментных препаратов согласно настоящему изобретению заключается в культивировании штамма Рзецс 1 опюпаз агпу 1 ос 1 егагпоза 5 Вна питательной среде, содержащей источники углерода, азота в присутствии необходимых для роста минеральных солей.В качестве источников углерода применяют крахмал, растворимый крахмал, декстрин, кислый гидролизат крахмала, ферментативный гидролизат крахмала, мальтозу и другие материалы, имеющие а,4- или а,6-глюкозидные связи,В качестве источника азота используют соли аммония, нитраты и мочевину вместе с глутаминовой, аспарагиновой кислотами или другими органическими азотсодержащи ми соединениями, например пептоном, кукурузным экстрактом, дрожжевым экстрактом, белковым гидролизатом и т. п. Органические вещества,могут использоваться без минеральных.Широко используется натуральная среда, состоящая из порошков риса и сладкого картофеля, в которой существует хорошее соотношение источников углерода и азота.Температуру культивирования поддерживают в интервале 20 - 30 С, рН 6 - 8. Для получения высокого выхода изоамилазы рН поддерживают в кислой области,После завершения культивирования клетки отделяют центрифугированием, жидкость может использоваться в качестве неочищенного ферментного раствора. Для получения препаратов изоамилазы проводят осаждение с помощью растворителя, высал иванне, адсорбцию, сгущение раствора и т. п.Фермент устойчив при рН 3 - 6. Изоамилгза, полученная в соответствии с настоящим изобретением, может использоваться для получения амилазы из крахмала и других целей.П р и м е р 1, Среду состава, %: мальтоза 2,0; глутамат натрия 0,2; (Х 11)НРО 0,3; КН 9 РО 1 0,1; Мдс 10 а 7 НгО 0,05; остальное вода; рН 7,0, засевают культурой Рзецс 1 огпопаз агпу 1 ос 1 ега 1 поза ЯВи процесс ведут при встряхивании при 30 С в течение 120 час. Культуральную жидкость, имеющую изоамилазную активность 180 - 220 ед/лл, центрифугируют при скорости 10000 об(лсин в течение 10 лин. Клетки отбрасывают, Жидкость охлаждают, перемешивают, добавляют 757 о-нь 1 й ацетон, Осадок фермента отделяют, лиофилизуют и получают изоамилазу в виде порошка. Выделение обеспечивает выход 80 - 90/о. Препарат устойчив, если хранится в сухом виде. Он может быть очищен обработкой сульфатом аммония или другим методом.Пример 2. Среду, имеющую состав, 7 о: растворимый крахмал 1,0; (МНд) НРО 0,3; КНеРО 0,1; полипептон 0,1; Мд 504 7 Но 0,05; остальное вода; рН 7,0, инокулируют тем же микроорганизмом, что в примере 1, Процесс ведут при 30 С в течение 72 час,Получают выход изомилазы 82%. Способ получения амилолитических ферметпых препаратов путем выращивания их продуцентов, например Рзецс 1 отпопаз, на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, в присутствии необходимых для роста минеральных солей, отличающийся тем, что, с целью получения изоамилазы, гидролпзующей только связанный с крахмалом а,6- глюкозид, в качестве продуцента используют Рзецс 1 огпопаз агпу 1 ос 1 егагпоза 5 В.