Штамм бактерий bacillus thuringiensis var. thuringiensis для получения энтомопатогенного препарата

Штамм бактерий Bacillus thuringiensis var thuringiensis ВКПМ В-3698 для получения энтомопатогенного препарата.

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и представляет собой новый штамм Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 202-Э, эффективный продуцент -экзотоксина и -эндотоксина, который используется для производства энтомопатогенных бактериальных препаратов.
Целю изобретения является получение нового штамма, обладающего более высоким синтезом -экзотоксина.
Штамм Bacillus thuringiensis var. thuringiensis получен из штамма Bac. thuringiensis var. thuringiensis 202. Для получения клетки штамма B. thuringiensis var. thuringiensis 202 выращивают в 5 мл (МПБ) 12 ч, разводят в 5 мл МПБ до плотности клеток 10⁶ кл/мл и выращивают при 43^оС на круговой качалке (260 об/мин) в течение 24 ч. Разведения выросшей культуры высевают на мясопептонный агар (МПА). Отдельные колонии проверяют на -экзотоксинообразование с помощью микробиологического теста, основанного на эффекте бактерицидного действия -экзотоксина на клетки Sareina flava, отбирают клоны с наибольшей зоной подавления роста клеток S. flava по сравнению с исходным штаммом.
Вновь полученному штамму бактерий Bacillus thuringiensis var. thuringiensis присвоили номер 202-Э. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером В-3698. Штамм имеет следующие морфологическую и физиологическую характеристики.
Морфологические признаки. Аэроб, грамположительная подвижная палочка. Размеры 4,3х1,9 мкм. В стационарной фазе роста образует овальные споры размером 1,9х1,4 мкм. Кристаллы крупные и мелкие, правильной ромбовидной формы.
Клетки штамма содержат кристаллы правильной ромбовидной формы (размером 1,8х2,2 мкм), кристаллы кубической формы (0,5х0,5; 1,7х1,7 мкм) и кристаллы неправильной формы различного размера.
Культуральные и физиолого-биохимические признаки. Штамм хорошо растет на мясопептонной среде. Через двое суток при температуре 30^оС на мясопептонном агаре образует матовые, светло-серые колонии, 3-5 мм в диаметре, со слабо изрезанным краем. Колонии имеют плоский профиль, мелкозернистую структуру маслянистую консистенцию. При суспендировании в воде образует равномерную муть.
На картофельном агаре в тех же условиях роста колонии более светлые. Консистенция пленочная. Остальные признаки те же, что и при росте на МПА.
При росте на питательном агаре на основе гидролизата кильки через двое суток колонии имеют более прозрачный и зернистый край. Консистенция маслянистая.
В мясопептонном бульоне образует тонкую кольцеобразную пленку, опадающую через 48-72 ч. Рост умеренный, осадок рыхлый.
Отношение штамма к источникам азота. Усваивает нитратные и аммонитные формы азота.
Отношение к источникам углерода. Усваивает с образованием кислоты глюкозу, сахарозу. Не усваивает аннозу, лактозу, целлобиозу. Разлагает салицин, эскулин.
Молоко пептонизирует. Разжижает желатину. Гидролизует крахмал. Зона просветления особенно четко видна после обработки агара раствором Люголя. Мочевину разлагает, слабо усваивает лецитин.
Патогенные свойства. Токсичен для личинок комнатной мухи и непарного шелкопряда. Подавляет рост клеток Sareina flava. Не обладает патогенностью для теплокровных животных.
Антигенные свойства. Относится к серотипу Bacillus thuringiensis.
Отношение к фагам. Устойчив к фагам 22, с/п, И-77, 17 и 25/16, собственных вирулентных фагов не выделяет.
Штамм 202-Э не имеет маркерных признаков.
Условия хранения штамма. Штамм 202-Э длительно сохраняет свои свойства при хранении его на картофельном агаре и МПА и 4^оС. После 15 пассажей с МПА на МПА с последующим посевом на дрожжеполисахаридную среду не отмечалось явления диссоциации или ухудшения полезных свойств штамма. При хранении штамма в течение трех лет на полужидком агаре под вазелиновым маслом и в лиофильно высушенном виде не наблюдалось снижения активности -экзотоксина, -эндотоксина и титра спор. Для длительного хранения штамма рекомендовано лиофильное высушивание в запаянных ампулах.
П р и м е р. Использование штамма для получения эндомопатогенного препарата.
Штамм 202-Э выращивают в течение 12 ч на косяке с МПА. Полученную культуру пересевают на дрожжеполисахаридную среду (ДПС) следующего состава: на 1 л воды, г, дрожжи 30; кукурузная мука 15; NaCl 2; CaCl₂ 0,5; MgCl₂ 0,25. Культивирование проводят в колбах емкостью 750 мл с 30 мл среды на круговой качалке при 260 об/мин и 30^оС в течение 48 ч. Центрифугируют при 5000 об/мин в течение 15 мин. Культуральную жидкость автоклавируют при 1 атмосфере 15 мин и определяют содержание экзотоксина с помощью жидкостной хроматографии высокого давления.
Сравнительная характеристика инсектицидной активности, фагоустойчивости и содержания -экзотоксина производственного штамма 620 М и полученного штамма 202-Э приведена в табл. 1 и 2.
Из данных, приведенных в табл. 1 и 2, следует, что по инсектицидной активности в отношении комнатной мухи и по количеству -экзотоксина (мл/л) штамм 202-Э превышает промышленный штамм 620 М на 30% А по инсектицидной активности спорокристаллического комплекса и по фагоустойчивости штамм 202-Э находится на уровне производственного.
В своем составе полученный продукт содержит низкомолекулярный термостабильный -экзотоксин нуклеотидной природы, секретируемый клетками в культуральную среду, -эндотоксин белковой природы и споры, освобождающиеся в конце споруляции к 40-46 часам роста (при выращивании штамма на дрожжеполисахаридной среде при 30^оС и 240 об/мин).
Штамм 202-Э как продуцент -экзотоксина превосходит известные штаммы (0,9 мкл культуральной жидкости формирует пятно на хроматограмме). По инсектицидной активности спорокристаллического комплекса он соответствует показателям штаммов 98, 2510, ИПМ 1140/27-2а, а по титру спор уступает им на порядок.
Данные количественного содержания -экзотоксина, полученные с помощью жидкостной хроматографии высокого давления, представлены в табл. 4.
Сравнивая показатели штаммов 98, 2510, ИПМ 1140/27-2а, 202 следует сделать заключение, что применение штамма 202-Э в качестве продуцента бактериальных препаратов, содержащих -экзотоксин (битоксибациллин, турингин 2 и др. ), позволяет получить экологичеки более безопасный препарат в связи с низким титром спор в культуре (при более высоком содежании -экзотоксина (на 30%), это позволяет увеличить его биоинсектицидную активность и снизить дозу применяемых препаратов.
Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и представляет собой новый штамм бактерий Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 202-Э, эффективный продуцент -экзотоксина и d -эендотоксина, используемый для производства энтомопатогенных препаратов. Целью изобретения является - получение нового штамма, обладающего более высоким синтезом b -экзотоксина. Штамм получен из штамма B. thuringiensis var. thuringiensis 202. Вновь полученному штаммуприсвоили номер 202-Э. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под N В-3698. Штамм позволяет получить препарат, содержащий 299 мг/л b -экзотоксина с титром клеток 1,4 10⁸, инсектицидная активность препарата LK₅₀ 0,29% (непарный шелкопряд), 2,54% - (комнатная муха). 4 табл.