Способ определения антител к ликопротеидам низкой плотности в крови

СОЮЭ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК И)5 С 01 Н ЗЗ/5.55 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Научно-исследовательский институт кардиологии Томского научногоцентра АМН СССР(54) СП 0 СОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ КЛИПОПРОТЕИДАМ НИНК 0 Й П 510 ТНОСТИ ВКРОВИ(57) Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано вклинической лабораторной диагностике. Цель изобретения заключается вразработке способа определения антител к липопротеидам низкой плотностив крови. Твердую Фазу обрабатываютИзобретение относится к иммунологии и может быть использовано в клинической лабораторной диагностикеЦелью изобретения является определение антител к липопротеидам низкойплотности (3 П 1 Н 11) в сыворотке кровичеловека.Сенсибилизация планшетов. В лунки96-луночных полистироловых планшетовс плоским дном заливают 0,1 мл раствора, содержащего 10 мкг/мп ЛПНП,0,02 М МаС 1 рН 8,0 (наслаивающийраствор). 11 ланшеты закрывают крышкао,ми и инкубируют при 36 С 2 ч и при4 С 15-18 ч, По окончании инкубации 2 раствором, содержащим 10 мкг/мл липопротеидов низкой плотности и 0,02 М 11 аС 1, рН 8,0, при 36 С в течение 2 ч с дальнейшим выдерживанием при 4 С в течение 15-18 ч с последующим проведением стадий твердойаэного имм - ноАерментного анализа, которые включают добавление исследуемой сыворотки крови человека, инкубацию, отмывку твердой Фазы, нанесение на нее конъюгата пероксидазы с антителами к им" муноглобулину Г, человека, повторную отмывку, нанесение хромогенной субстратной смеси, остановку пероксндазной реакции и расчет содержания аптител к липопротеидам низкой плотности по калибровочной кривой. Разработанный способ позволяет определить минималь= ную концентрацию антител к липопротеидам низкой плотности в сыворотке крови человека, равную 15,6 нг/мп,Ф раствор Л 11 НП удаляют и лунки трижды промывают 0,05 У,-ным раствором твина 20 1-2 мин и водопроводной водой. Подготовка калибровочного материала, Разведения калибровочного материала, кратные двум, готовят на 0,01 М растворе АасФатно-солевого буФера, рН 7,4 (фСБ) с 0,05 У;ным раствором твина 20. Готовят смесь разведений от 1 мкг/мл до 15,6 нг/мл иэ донорских сывороток.Внесение исследуемого и калибровочного материала. Калибровочный ма- териал вносят в лунки в объеме 0,1 мл.Исследуемые образцы плазмы или сыворотки крови вносят по О,1 млпри разведении 1;1 ОО в ФС 1, содержащем О,О 5% твинаО. После внесения5материала планшеты закрывают крышкамии инкубируют в термостате 3 ч прио52 С. Содержимое лунок удаляют, планшет промывают струей водопроводнойводы, затем на 1-2 мин заполняют О,О 5% 1 Отвини вновь ополаскивают водопроводной водой, 11 роцедуру отмывки планшета повторяют трижды,Внесение конъюгата, В каждую лункувносят по О, 1 мл разведенного раствора конъюгата пероксидазы с антителамик иммуноглобулинам ( человека и инкЪ -бируют 1 ч при 36 С. Отмывку планшетао,проводят аналогично описанной.Внесение субстратной смеси и остановка ферментативной реакции. На 1планшет готовят смесь, содержащую5 мг ортофенилендиамина, 15 мл О,О 5 Мцитратного буфера, рН 7,4 и 1 О мклраствора гидролерита. Субстратнуюсмесь вносят в каждую лунку в объемеО,1 мл и инкубируит в темноте прикомнатной температуре 1 Омин. Остановку реакции проводят внесением влунку по 5 О мкл 25/-ной серной кислоты, после чего планшет встряхивают.Регистрация результатов. Регистрацию результатов проводят с использованием фотометра с вертикальным ходомлуча при длине волны 492 нм или визу 35ально.При инструментальной регистрациина миллиметровой бумаге строят калибровочную кривую зависимости поглощения от концентрации антител к Л 11 НП.Для определения концентрации антител к ЛПНИ в образце сыворотки нагоризонтальной оси находят точку,соответствующую величине поглощенияее ферментативной реакции (среднеезначение двух лунок) и результат умножают на 1 ОО (скрининг-титр изучаемого образца сыворотки),Апробация метода проведена на пуледонорских сывороток крови (не менее1 О(О образцов),50Минимально определяемая концентрация аутоантител к ЛПНП 15,6 нг/млсыворотки крови человека,П р и м е р 1. При изменении концентрации МаС 1 л наслаивающем раство 55ре до О,О 1 и О,(3 Е рН 8,О происходит снижение количества иммобилизированных 11 Н 11, на 19 и 2 Г/ соответственно определенное по количествусвязываемых антител к 1 ПНП.П р и м е р 2, 11 ри изменении рНсреды насливающего раствора до 7,Ои 9,О происходит снижение количестваиммобилизированных Л 11 НП на 27 и 35/соответственно,П р и м е р 3. При изменении времени инкубации планшетов с 2 ч до1 и 3 ч при 36 +1 С (последующая инокубация при 4 С общепринята) происо,ходит снижение количества иммобилизированных ЛПНП на 46 и 23% соответственно.П р и м е р 4, 11 ри изменении концентрации наслаиваемых ЛПН до 9 и11 мкг/мл происходит снижение количества иммобилизированнь(х 11 ПНП на 7 и9% соответственно,П р и м е р 5. При инкубации П 1 НПо, . о,в лунках планшета при 34 С и 38 Сколичество антител к Л 11 Н было определено равным 12,3 кг/мл и 11,8 кг/Млсоответственно, Режим инкубации лрио36 С позволил определить количествоантител, равное 15,6 кг/мл.Таким образом найденный режимсорбции ЛНП на твердой фазе позволяет проводить количественное определение антител к ЛПНП с помощью иммуноферментного анализа,Формула изобретенияСпособ определения анТител к липопротеидам низкой плотности в крови путем обработки твердой фазы раствором, содержащим 1 О мкг/мл лилопротеидов низкой плотности и О,О 2 ММаС 1, рН 8,О при 30 С в течение 2 ч с дальнейшим вл(церживанием при 4 С в течение 15-18 ч и проведения последующих стадий твердофаэного иммуноферментного анализа, включающий добавление исследуемой сыворотки крови человека, инкубацию, отмывание твердой фазы, нанесение на нее конъю гата пероксидазы с антителами к иммуноглоблину С человека, повторное отмывание, нанесение хромогенной субстратной смеси, остановку пероксидаэной реакции и расчет содержания антител к липопротеидам низкой плотности по калибровочной кривой.