Способ определения клеточного иммунитета к вирусу гриппа

СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИ СПУБЛИК 33 сМВЗВ 1:Еф" А ЕТЕН(21) 4 (22) 2 (46) 1 (71) Л ский ый доброволец после ревакцизной вакциной локтевой вены и и перенесли ед. гепарина, тельной средой % инактивироьей сыворотки /мл мономици мл градиента клеток во флааствора ЭДТА, едой 1/1, и и н- С Далееил ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ И АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬ 45109/14(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА К ВИРУСУ ГРИППА Изобретение относится к. медицине частности к методам диагностики,Цель изобретения - упрощение способа путем использования в качестве клеток системы фагоцитирующих макрофагов моноцитов периферической крови.Это достигается тем, что в качестве фагоцитирующих мононуклеаров используют моноциты периферической крови и по увеличению цитотоксической активности лимфоцитов сенсибилизированных лиц определяют клеточный иммунитет к вирусугриппа,П р и м е р 1. Испытуем Б, исследован через 21 день нации живой противогриппО А (Новошахтинск, 1(86), Из шприцем взяли 6 мл кров во флакон, содержащий 120 Кровь развели до 15 мл пита (среда Игла, содержащая 10 ванной эмбриональной теляч 20 ед/мл гепарина и 100 мкг на и по 7,5 мл наслаивали на 51)5 О 01 И 1/28, 33/4(57) Изобретение относится к методам диагностики. Целью изобретения является упрощение способа, Это достигается тем, что в способе определения клеточного иммунитвта к вирусу группа по цитотоксическому поражению иммунными менфоцитами клеток системы фагоцитирующих менонуклеар з, зараженных вирусом, в качестве фагоци гирующих мононуклеаров используют моноциты периферической крови и при увеличении цитотоксической активности лимфоцитов сенсибилизированных лиц определяют клеточный иммунитет к вирусу группа,фиколлверографин с плотностью 1,077 г/см, У После центрифугирсвания (35 мин при 1500 ( об/мин) взяли интерфазу, содержащую мононуклеарные клетки, отмыли в 10 мл пита- Я тельной среды, отцентрифугировали 10 мин при 1500 об/мин, осадок развели 10 мл питательной среды и осуществили разделение мононуклеарной суспензии на прилипающие и не прилипающие клетки,С этой целью суспензию мононуклеар- ОО ных клеток перенесли во флакон для клеточ ных культур (125 мл). Флакон инкубировали Со при 37 С в течение 1 ч. Затем жидкость, С) содержащую лимфоциты, отбирали и сохраняли при 37 С до использования, Перед применением в качестве эффекторов ф клеточную суспензию центрифуги ровали 10 мин при 1500 об/мин, осадок оазводили питательной средой до соответствующей концентрации,Для снятия прилипших кон наливали 6 мл 10 мм р разведенного питательной ср кубировали 15 мин при 371698680 Составитель В,БабинковТехред М.Моргентал Корректор Т,Палий Редактор Н.Федорова Заказ 438: 1 ираж Подписное В.цИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент",.г, Ужгород, ул. Гагарина, 101 кость сливали, клетки осаждали и дважды промывали питательной средой(режим центрифугирования - 10 мин при 1500 об/мин). Клеточный Осадок совержащий 90% моноцитов, разводили питательной средой и рассеивали В полистироловую 96-луночную круглодонную микроплату по 200 тыс, клеток на лунку в объеме 0,2 мл, всего использовали 15 лунок. Микроплату оставляли на ночь (16 ч) в термостате при 37 С, Затем клеточный монослой заражали вирусом гриппа А (РР) 34 (Н 1 Ю), используя стерильнуоВирусосодержащуо аллантоисную жидкось (ВАЖ) развивающихся куриных эмбрионов, разведенную до титра гемагглю инича 10 (0,2 мл), ПредВарительнО из лунок с моноцитами удаляли надосадочную жидкость, лунки промывали питательной средой и после отбора последней наносили БА;.К по 0,2 мла лунку. После инкубации в течение 1 ч при 37 С ВАЖ удаляли, лунки дважды прОмывали среДОЙ Игла, Добавляли по д,2 мл питательной соеды и продолжали лнкубирование при 37 С в течение 4 ч, Зате" надосадочную жицкОсть удаляли, клет :.и промывали среЦОЙ Игла и Добавляли ко".ск: - нейтральный, расный по 0,2 мл на л,:.",;.:, В В:".Де 0,04-ного раствора в среде ,е. - ,;.са, Пгпсле инкубации при 370 С надосадоччую жилкость удаляли, клеточныЙ мочослой громывали средой Игла, Добавляли питател нгю сов ву и инкубировали 1 ч пригдЗатем в 5 лучок после удаления питательной среды добавляли суспензию лимфоцитов - 860 тьс.клеток в объеме 0,2 мл питательной среды на лунку (соотношение моноцитов и лимфоцитов 1:4,3), в остальных 10 лунках с моноцитами меняли питательную среду и микроплату Оставляли для инкуаации при 37 С в течение 16 ч,После окончанля инкубацли надосадочну О жидкость сливали, микроплату дважды промывали путем погружения в забуференный ОЯ,-ный раствор хлористого натрия (рН 7,2), Нейтральный красный освобождали из моноцитов добавлением в каждую лун-,ку на 10 мин 0,2 мл 0,05 М раствора уксуснойкислоты в 50% этанола. Смесь из лунок отбирали, доводили до объема 1 мл забуфе 5 ренным 0,90 -ным раствором хлористогонатрия и определяли оптическую плотностьна спектрофотометре (СФ) при 540 нмпротив контрольного раствора(0,2 мл 0,05 М,уксусной кислоты в 50% этаноле + О, 8 мл10 забуференного 0,9%-ного раствора хлористого натрия),Для осуществления способа потребовалось 48 ч.Оптическая плотность жидкости из 1015 лунок с моноцитами равнялась в среднем0,080,02. Оптическая плотность жидкостииз 5 лунок, содержащих моноциты и лимфоциты, равнялась 0,03 + 0,01. Различие статистически достоверно (Р 0,05), Лизис20 моноцитов 630 .При исследовании цитотоксической активности лимфоцитов крови данногс волонтера в периоде до вакцинации и через 8дней после вакцинации лизис моноцитов25 составил соответственно 9 и 3.Результаты исследов-.ния свидетельствовали О поеи цитОтоксическойактивности лимфоцитов вакцинированныхлиц к моноцитам, инфицированным ВируЗО сом гриппа, формировании у них клеточногоиммунитета.Формула изобретенияСпособ определения клеточного иммунитета к вирусу гриппа по цитотоксическому35 поражению иммунными лимфоцитами клеток системы фагоцитируощих мононуклеаров, зараженнь 1 х вирусом, о т л и ч а ю щ и ис я тем, что, с целью упрощения способа, вкачестве фагоцитирующих мононуклеаров40 используют моноцить 1 периферической кроВи и при увеличении цитотоксической активности лимфоцитов сенсибилизированныхлиц Определяют клеточнь 1 й иммунитет к вирусу гриппа,45