Способ культивирования аденогипофиза куриного зародыша

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКРЕСПУБЛИК 12 й 5/- ттТ-и тежтъ-е.лт ",:О 1 тЙЕвт 11;р Г ., ,;,, .ф" "ю т ЕНИ РЕ 9 - 185.НИЯ АДЕНОДЫШАклеточной бииментальнойнологии, Цельсохранности Сь ЬЭ ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗОБ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(54) СПОСОБ КУЛ ЬТИВИРОВАГИПОФИЗА КУРИНОГО ЗАРО(57) Изобретение относится кологии, в частности к эксперэмбриологии и нейтроэндокриизобретения - обеспечение Изобретение относится к клеточной биологии, в частности к экспериментальной . эмбриологии и нейроэндокринологии,Целью изобретения является обеспечение сохранности тканевой структуры и органотипического развития аденогипофиза.Способ осуществляют следующим образом.Готовят жидкую питательную среду по любому известному способу, Подготавливают плоты, предназначенные для удержания эксплантатов на разделе жидкой и газообразной сред во время культивирования. Из гидрофобных материалов наиболее пригодным для изготовления плотов является полиэтилен, обладающий удельной плотностью меньше плотности воды, гидрофобными свойствами и механической прочностью. Плоты из полиэтилена изготавливают в виде дисков толщиной не менее 0,5 мм; диаметром 8,5 мм, в центре диска просверливают.Ю , 1661210 тканевой структуры и органотипического развития аденогипофиза, Эксплантаты аденогипофиза располагают на поверхности пористого субстрата, например мембранного фильтра. Последний накладывают на плот, представляющий собой полиэтиленовый диск толщиной 0,5 - 0,7 мм с отверстием в центре. Нагруженный плот помещают в жидкую питательную среду и культивируют в атмосфере с 50 о С 02 в течение 7 - 13 сут со сменой среды через каждые 2-е суток. Способ обеспечивает органотипическое развитие аденогипофизарной ткани и дифференцировку специфических клеток аденогипофиза,отверстие диаметром 3,5 - 4 мм, противоположные стороны диска обрезают в аиде двух параллельных граней, служащих для захватывания и удержания плота пинцетом. Для повышения плавучести плотов их шлифуют на листе из того же материала. Плоты перед использованием стерилизуют 70-ным этиловым спиртом, промывают в стерильной дистиллированной воде и высушивают под а ультрафиолетовой лампой. СУ куриных зародышей в стерильных условиях выделяют вдеиофипофив о прилежв я щей мезе нхимой, изолируя его от промежуточного мозга, Сепарирование тканей проводят под микроскопом в среде для культивирования. Эксплантаты в количестве 1 - 3 шт. помещают на пористый субстрат - миллипоровый фильтр размером Зх 5 мм (тип НА, диаметр пор 0,45 мкм). Фильтры с эксплантатами укладывают на плот, нагруженные плоты переносят пинцетом в1661210 45 Составитель А, РоманченкоРедактор М, Стрельникова Техред М.Моргентал Корректор И. Муска Заказ 2097 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 культуральные чашки на поверхность питательной среды. В одной пластиковой илистеклянной чашке Петри диаметром 35 - 45мм, содержащей 3-4 среды, размещают до7 плотов с эксплантатами,Культивированиетканей проводят при 38 С в атмосфере с 5;С 02 в течение 7 - 13 сут, среду меняют черезкаждые 2 суток,Плоты на поверхности жидкой средыгруппируются в центре чашки Петри, не набухают и не тонут. Культуральная среда по" ступает к эксплантатам через центральное. отверстие плота и фильтр, Плоты не деформируются при захватывании и переносе ихс помощью пинцета, что исключает возможность механического повреждения эксплантатов.По окончании культивирования плотыотмывают от среды в растворе детергента,шлифуют, промывают дистиллированнойводой и хранят в 70-ном этиловом спиртедо повторного использования,Контроль эффективности способа осуществляют путем гистологического и иммуногистохимического исследованийэксплантатов по окончании культивирования, как показано в следующих примерах,П р и м е р 1. Культивирование проводятпо описанному способу, Аденогипофиз выделяют у зародышей кур белый Леггорн на7-е сутки инкубации. В качестве питательной среды используют культуральную средуОМЕМ, содержащую фетальную бычью сыворотку 10;ь, куриный эмбриональйый экстракт 10 , пенициллин 50 ед/мл,стрептомицин 50 мкг/мл. Применяют полиэтиленовые плоты толщиной 0,5 мм. Продолжительность культивирования 9 и 13 сут.Во всех эксплантатах при гистологическоми иммуногистохимическом исследованияхобнаружено органотипическое развитиеткани в виде разрастаний клеточный тяжейи дифференцировка специфических клеток,5 10 15 20 25 30 35 40 содержащих соматотропный гормон (СТГ). В части клеток выявлена экспрессия д -кристаллина, характерная для нормального развития аденогипофиза у куриных зародышей,П р и м е р 2. Культивирование проводят по описанному способу. Зачатки аденогипофиза на стадии кармана Ратке выделяют у зародышей кур белый Леггорн через 4,5 сут. ин кубации. Переднюю часть зачатка, включающую презумптивную цефалическую долю аденогипофиэа, используют для эксплантации в органной культуре. Применяют жидкую питательную среду, приготовленную на основе культуральной среды ВРМ 1640 с добавлением 10;4 фетальной бычьей сыворотки и ростстимулирующих реагентов. Для поддерживания эксплантатов на поверхности жидкой среды используют полиэтиленовые плоты толщиной 0,7 мм. Продолжительность культивирования 7 сут.Специальное исследование показывает, что при культивировании аденогипофиза зародыша кур происходит органотипическое развитие аденогипофизарной ткани и дифференцировка специфических клеток аленогипофиза, что выявляется различными антисыворотками к пролактину, аденокортикотропному гормону, хориальному гонадотропину человека.Формула изобретения Способ культивирования аденогипофиза куриного зародыша, включающий выделение эксплантатов аденогипофиза и культивирование их в жидкой питательной среде, отличающийся тем,что,сцелью обеспечения сохранности тканевой структуры и органотипического развития аденогипофиэа, эксплантаты помещают на пористый субстрат, который располагают на плоту, выполненному из полиэтилена толщиной 0,5 - 0,7 мм, имеющего в центре отверстие,