Способ получения пепсина рыб

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 1652342 1)5 С 1289 ГОСУДАРСТВЕННЫПО ИЗОБРЕТЕНИЯМПРИ ГКНТ СССР ОМИТЕТОТКР ЫТИ ТО са 1 оп апб сЬагас агст 1 с йзЬ Маото в МУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Научно-исследовательская лаборатория биологически активных веществ гидробионтов(56) ЯапсЬег-СЫапд 1 С 1 мегпаз Е., Ропез О. Рап 1 ае рогЯсам оп о 1 рерз 1 пз Фгогп абиев апб )цчепа 1 за 1 пюп йзп Огсогпупспоз Кеда, - СоерогасЬе ВосЬев 1 зтгу апб Роузооду, 1987, ч. 87 В, р. 793-797.61 Ьегд А. РОГОтег 1 гат 1 оп от рерз 1 пз 3 ч 1 Поп 1 з.(54) СПОСОБПОЛУЧЕНИЯ ПЕПСИНА РЫБ (57) Изобретение относится к биотехноло гии, а именно к способу получения пепсина Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения препарата пепсина из внутренних органов рыб, который может найти применение в научноисследовательской деятельности, медицине, пищевой и кожевенной промышленности.Цель изобретения - повышение удельной активности целевого продукта и его выхода, а также упрощение способа,Способ заключается в том, что в качесте сырьевого источника пепсина используют всю массу внутрен их органов, содержащихся в брюшной полости рыб(желудок, кишечник, печень, почки и т.д.), которые гомогениэируют в растворе рН 2-6. Затем гомогенат инкубируют в течение 3 - 20 ч при комнатной температуре и центрифугииэ внутренних органов рыб. Цель изобретения -повышение удельной активности целевого продукта и его выхода. а также упрощение способа. Способ заключается в том, что в качестве сырьевого источника пепсина используется вся масса внутренних органов, содержащихся в брюшной полости рыб (желудок, кишечник, печень, почки и т,д.), которые гомогенизируют в растворе рН 2 - 6, Гомогенат инкубируют в течение 3-20 ч при комнатной температуре и центрифугируют. Значение рН супернатанта доводят до 1,7 - 2,4 и инкубируют 15-30 мин при комнатной температуре. Значение рН доводят до 4,4 центрифугируют, диалиэуют и подвергают очистке методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-носителе. Удельная активность пепсина по отношению к гемоглобину равна 1400 - 2800 ед/мг белка, выход по активности равен 30 - 87 О. руют в течение 30 мин при 19000 д, 4 С, Для активации пепсиногена рН гомогената доводят до 1,7-2,4 и инкубируют 15 - 300 мин при комнатной температуре, Для окончания реакции активации рН поднимают до 4,4 с помощью 4 М раствора ацетата натрия. Для отделения образовавшегося осадка раствор центрифугируют при 19000 д в течение 40 мин. Супернатант диализуют против 5 мМ ацетатного буфера, рН 5, а в последствии наносят на колонку с ДЭАЭ-носителем, уравновешенным тем же буфером, Ферментативную активность элюируют тем же буфером. Удельная активность пепсина по отношению к гемоглобину равна 1400-2800 ед/мг белка. Выход по активности равен 30-87 ф 6, 1652342При проведении гомогенизации при рН выше 6 наблюдают понижение удельной активности целевого продукта. Аналогичный эффект наблюдают в растворах с рН ниже 2.Экстракция пепсина в течение менее 3 ч приводит к понижению выхода. В интервале 3 - 20 ч величина выхода не изменяется, 20-часовую экстракцию проводят в течение , ночи, что позволяет более рационально проводить процесс. Дальнейшее увеличение времени экстракции нецелесообразно.Инкубация ферментного раствора при рН выше 2,4 и ниже 1,7 приводит к понижению удельной активности целевого продукта и его выхода.Время инкубации пепсина при кислых рН выбрано на основании того факта, что при инкубации меньше 15 мин удельная активность пепсина невысока. Вместе с теминкубация в течение более 300 мин (по-видимому, за счет инактивации) понижает величину активности целевого продукта.П р и м е р 1. 175 г внутренних органов мойвы гомогенизируют в 500 мл 5 мМ ацетатного буфера, рН 5, Гомогенат инкубируют в течение 20 ч при комнатной температуре, а затем центрифугируют в те, чение 30 мин при 19000 9, 4 С, Для активации пепсиногена рН гомогената доводят до 2 с помощью 2 н. НС и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Для окончания реакции активации рН поднимают до 4,4 с помощью 4 М раствора ацетата натрия, Для отделения образовавшегося осадка раствор центрифугируют при 19000 9 в течение 40 мин. Супернатант диализуют против 5 мМ ацетатного буфера, рН 5, а впоследствии наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной тем же буфером. Ферментативную активность элюируют тем же буфером. Удельная активность пепсина по отношению к гемоглобину равна 1400 ед/мг белка. Выход по активности равен 64.П р и м е р 2. 175 г внутренних органов анчоуса гомогенизируют в 500 мл 10 мМ НС, рН 2, Гомогенат инкубируют в течение 30 мин при 19000 9, 4 С, Для окончания реации активации рН поднимают до 4,4 с помощью 4 М раствора ацетата натрия, Для отделения образовавшегося осадка раствора центрифугируют при 190009 в течение 40 . мин. Супернатант диализуют против 5 мМ ацетатного буфера, рН 5, а впоследствии наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной тем же буфером. Ферментативную активность элюируют тем же буфером. Удельная активность пепсина по отношению к гемоглобину равна 1400 ед/мг белка. Выход по активности равен 87. П р и м е р 3; 175 г внутренних органованчоуса гомогенизируют в 500 мл 5 мМ ацетатного буфера, рН 6, Гомогенат инкубируют в течение 4 ч при комнатной 5 температуре, а затем центрифугируют в течение 30 мин при 19000 9, 4 С, Для активации пепсиногена рН гомогената доводят до 1,7 с помощью 2 н. НС и инкубируют 15 мин при комнатной температуре. Для окончания 10 реакции активации рН поднимают до 4,4 спомощью 4 М раствора ацетата натрия. Для отделения образовавшегося осадка раствор центрифугируют при 19000 9 в течение 40 мин. Супернатант диализуют против 5 мМ 15 ацетатного буфера, рН 5, а впоследствиинаносят на колонку с ДЭАЭ-сферонитом, уравновешенным тем же буфером. Фермен. тативную активность элюируют тем же буфером. Удельная активность пепсина по 20 отношению к гемоглобину равна 1500 ед/мгбелка, Выход по активности равен 37.П р и м е р 4. 175 г внутренних органовсельди гомогенизируют в 500 мл 5 мМ ацетатного буфера, рН 4, Гомогенат инкубиру ют в течение 3 ч при комнатнойтемпературе, а затем центрифугируют в течение 30 мин при 19000 9, 4 С, Для активации пепсиногена рН гомогената доводят до 2,4 с помощью 2 н.НС и инкубируют 300 мин 30 при комнатной температуре, Для окончанияреакции активации рН поднимают до 4,4 с помощью 4 М раствора ацетата натрия. Для отделения образовавшегося осадка раствора центрифугируют при 19000 д в течение 40 35 мин, Супернатант диализуют против 5 мМацетатного буфера. рН 5, а впоследствии наносят на колонку с ДЭАЭ-сфероном, уравновешенным тем же буфером. Ферментативную активность элюируют тем же 40 буфером. Удельная активность пепсина поотношению к гемоглобину равна 2800 ед/мг белка. Выход по активности равен ЗО. Формула изобретения 45Способ получения пепсина рыб, включающий гомогенизацию исходного сырья, активацию и очистку,.о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения удельной активности целевого продукта и его выхода, а 50 также упрощения способа, в качестве исходного сырья используют все внутренние органы из брюшной полости рыб, гомогенизацию ведут в растворе с рН 2-6 в течение 3-20 ч, активацию проводят при рН 55 1,7-2,4 в течение 15-300 мин, а очистку осуществляют методом ионообменной хроматографии на анионообмен нике, содержащем диэтиламиноэтильные группы,