Штамм бактерий рsеudомоnаs sтuтzеri продуцент рестриктазы psu i

(19) (11) 1)5 С 12 й 9/14 ОСУДАРСТВЕННЫЙО ИЗОБРЕТЕНИЯМРИ ГКНТ СССР МИТЕТОТКРЫТИЯМ 5 - 1 х 1,5-4 мкм, полярных жгутик ачестве е может и цетат, ц оэу, 2-кет еродин,регал АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(56) С 1 пдегаз М.й., Огеепоцд) 1., ЯсЫЫ(гацт1., ЙоЬег(з ВЛ, Тччо пев геворгс 11 оп епбопцс 1 еазев9 ое Рготецз чцдаг 1 з, - 1 Мцс 1 е 1 з Асбз Вез1981, ч 9, М 18, р, 4525 - 4536. 54) ШТАМ БАКТЕРИЙ РЯЕОООМОИАЯЯТОТЕЕВ 1 - ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗЫРЯО 1 относится к биотехнолоет собой штамм, который ьзован для получения реИзобретениегии и представляможет быть исполстриктазы. Рзц 1Цель изобретения - получение штамма Рзец(оп)опаз мциег (131) ВКПМ В, обладающего более высоким уровнем синтеза рестриктазы, узнающей палиндромную, 5 СОАТСОЗпоследовательность и являю 310 СТАО С 5щейся гомогенно чистой.Штамм Рзецс 1 оглопаз з 1 цтгег (131) ВКПМ Ввыделен из почвы с последующим отбором вариантов, имеющих высокую продуктивность рестриктазы Рзц 3. Штамм имеет следующие характеристики,Морфологические признаки.Клетки одиночные, палочковидные, прямые или изогнутые, но не спиральные, раз(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в генной инженерии и молекулярной биологии. Цель изобретения - получение штамма Рзецс 1 ол)опав зтц 1 ег 1 В(131), обладающего более высоким уровнем синтеза рестриктазы, узнающей палиндромную5 С(А СЗпоследовательность и вю 3 О СТАОС 5щейся гомогенно чистой, Штамм культивируют на среде 3 с рыбным гидролизатом, В результате использования штамма Рзецдовопаз зсцтгег ВКПМ Ввыход биомассы составляет 6,0-7,5 г/л культу- ральной жидкости, а выход рестриктазы Рзц 16000 - 9000 ед/г биомассы или 36000-67500 а ед/л культуральной жидкости, 1 табл. меры О. движутся с помощью ов Грамотрицательные,Физиолого-химические признаки,Метаболизм дыхательный (ассимилируют глюкозу на среде Хью-Лейфсона по окислительному типу), обладает уреазной иаргининдегидролазной активностью,Пигментов не содержит, растет при 430 С, не растет при 420 С(оптимальная температура роста 25 С),Леван из сахарозы .не образуется, неразжижает желатину и не гидролизует полиР -оксибутират, гидролизует крахмал. инственного источника угпользовать глюкозу, 1:ваитрат и не использует глюконат, мезо-инозит, 3-аланин, О:аргинин. При ассимиляции глюкозы образуется кислота.Сероводород не образуется, реакция Фогес-Проскауэра отрицательная, тест с метиловым красным отрицательный,Фенилпируват не образуется (реакция на наличие фенилаланиндезаминаэы отрицательная).Факультативные аэробы. Оксидаэо- и каталаэоположительные.Культуральные признаки,Рост на косяках густой, сплошной. Штрих широкий, четко видный. При попадвник на твердую среду влаги растет в виде сплошной пленки по всей поверхности. При выращиваний культура в чашках Петри на твердой среде через 24 ч образуются полупрозрачные точечные колонии размером 0,1-0,2 мм, Через 38 ч образуются белые, круглые, полупрозрачные, совершенно гладкие, влажные, однородные, выпуклые, блестящие с гладким краем колонии,. Размерр таких колоний в диаметре 2-2,5 мм. По всей консистенции они являются маслянистыми (подобие сливочного масла),Колонии не пигментированы.Штамм Рзецбовоавз з 1 циег 131 имеет сильный запах при росте на твердой или жидкой среде.При росте в бульоне образуется обильный осадок.Хорошо растет на жидкой питательной среде, содержащей 50 г/л рыбного гидролиэата и до 1,0 л воды, рН 7,2-7,4. Нв такой питательной среде штамм растет при температуре 25-27 ОС, аэрации 2 обьемв воздуха на 1 обьем питательной среды в течение 5 - 6 ч. При выращивании штамма на питательной среде данного состава происходит помутнение среды, что свидетельствует о сильном росте культуры. Рост глубинный и пленки на поверхности не образуется, Осадок, состоящий из клеток Рзецбоеопаз з 1 ц 1 аег 131, тягучий, при воздействии нв него лиэоцимом быстро происходит лиэис клеток, Количество осадка обильное, цвет осадка светло-серый.Штамм фагоустойчив, Не лиэируется в присутствии фагов СЬ 4 А,А, МЗ 2, 0 Р.Штамм чувствителен к ампициллину в концентрации 25 мкг/мд, Штамм дает выход биомассы 6,0-7,5 г/л культуральной жидкости, имеет выход рестриктаэы Рзц 1 6000-9000 ед/г биомассы или 36000-67500 ед/л культуральной жидкости, биосинтезирует одну сайт-специфическую эндонуклеаэу Рзц 1, являющуюся гомогенно чистой.Выращивают культуру на питательной среде известного состава при рН 7,2, температуре 25 ОС, аэрации 2 обьема к 1 обьему питательной среды до поздней логарифмической фазы роста. Выход биомассы 6,0 - 7,5 л/г культуральной жидкости; выход рестриктаэы Рзц3000 - 4500 ед/г биомассы или 18000 - 33750 ед/л культуральной жидкости.Сравнение уровней продуктивности штаммов - продуцентов рестриктаэ - иэошиэомеров рестриктаэы Рзц 1 представлеП р и м е р. Штамм бактерий .Рзецбоаопаз зСцтлег 131 выделен иэ почвы, Для получения изолированных колоний берут 10 г почвы (иэ расчета абсолютно сухой) и взбалтывают с 90 мл воды в течение 5 мин. В дальнейшем используют метод предельных разведений, заключающийся в последовательном переносе 1 мл суспенэии в пробирку с 10 мл стерильной воды, хорошо перемешивают и иэ данной пробирки 1 мл суспенэии переносят во вторую пробирку и т,д. Всего делают 8 - 9 разведений, иэ каждого разведения производят посев 0,1 мл суспензии в чашки Петри. с твердой питательной средой, содержащей 3,5 ф сухого питательного агара и воду).Все выросшие в чашках Петри колонии изучают микроскопически на наличие биохимических признаков, в том числе на наличие активности рестркктаэы Рзц 2. Полученные колонии Рзецботопаз змсгег в активностью фермента Рзц 1 селекционируют с целью получения наиболее активных вариантов.Проверку продуктивности штамма бактерий Рзецбовопаз зтциег (131) ВКПМ В ведут в сравнении со штаммом Ргоецз чц 9 аг 3 АТСС 133115 ВКПМ В, который синтезируют аналогично рестриктаэу и экспериментально проверен в лабораторных условиях на НПО "Биолар".Готовят среду для выращивания штамма следующего состава: 50 г/л рыбного гидролиэата к 1,0 л воды. Оживление штамма Изецдоглопаз звиег 131 осуществляют на сухом питательном агаре (35 г/л сухого питательного агара и 1,0 л воды) в чашках Петри. Инкубируют в термокамере при 26 С в течение 18 ч,С поверхности агара в чашках Петри культуру переносят бактериологической петлей в качалочные колбы с питательной средойданного состава, рН 7,2,Выращивают посевной материал при 26 С в течение 18 ч на качалке.Ферментацию культуры проводят на питательной среде данного состава при рН 7,2, температуре 26 С, перемешивании 200.Петрова Техред М.Моргентал Корректор Т.Малец Реда кт каз 1747 Тираж 371Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва. Ж, Раушская наб 4/5 роизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 об/мин, подаче воздуха - 2 обьема воздуха на 1 обьем питательной среды.Выращивают до поздней логарифмической фазы роста, Выход биомассы 6,0-7,5 г/л культуральной жидкости, выход ре стриктазы Рзц Я 6000-9000 ед/г биомассы или 36000-67500 ед/л культуральной жидкости,Таким образом, при использованииштамма Рвецбовопав зтциег (131) ВКПМВпо сравнению с известным способомвыход рестриктазы Рзц 3 возрастает с 1000до 6000-9000 ед/г биомассы.Формула изобретенияШтамм бактерий Рзецбоеопаз змиегВКПМ В- продуцент рестриктазы Ры 1,