Способ выделения и культивирования протопластов из растительных тканей сои

иотехноой и геповы роще ью из овыхода тения являет отопластов и н кач ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМРИ ГКНТ СССР(71) Институт ботани Холодного АН УССР(56) Тгхсо 1 0.М. ег, а 1. Сц 1 ТцгеоЕ яоуЪеап шеяорЬУ 11 ргоор 1 авя1.п а 1 цхпае Ьеайя. -Р 1 ап Се 11 Кер.,1986, 5,5, 334-337,(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПРОТОПЛАСТОВ ИЗ РАСТИТЕЛЫ 1 ЫХТКАНЕЙ СОИ(57) Изобретение относится к биотехИзобретение относится к логии, в частности к клето нетической инженерии расте ние процесса культивирования.Способ состоит в том, что в естве источника протопластов используют незрелые зародыши сон диаметроь 1-10 мм.Способ осуществляется следующим образом.Незрелые семена сои извлекают из стручков и поверхностно стерилизуют 1 Е-ным раствором диоцида в течение 10 мин. После этого их отмывают дистиллированной водой и снимают верхнюю кожуру. Зародыши мелко нарезают и переносят в ферментативный раствор следующего состава, 7: Опояц 1 а К0,8; Масегозутпе 0,4; Пг 1 ве 1 аяе 0,02;,ЯО 15499 нологии, в частности к клеточной игенетической инженерии растений.Целью изобретения является повышениевыхода протопластов и упрощение процесса культивирования, В качестве источника протопластов используют незрелые зародыши сои, последующее кул тивирование осуществляют в жидкои питательной среде. Способ позволяет обойтись без ряда трудоемких процессов и операций культивирования, существенно повышает выход протопластов и частоту деления, а также является более дешевым по сравнению с ранее известными.с Ресг 1 паяе 0,4; Се"2 НО 15; БаС 1 9;1 г/л.После 16-часовой инкубации в растворе протопласты Фильтруют через капроновый фильтр (диаметр пор100 нм) и осаждают центрифугированием при 500 я в течение 1 мин, Осадок суспендируют в свежей среде Ъ 5 и наслаивают на 0,5 М сахарову.После центрифугирования в течение 4 мин при 500 я флотирующие протопласты собирают, суспендируют в питательной среде И 5 и осаждают. Осадок протопластов суспендируют в питательной среде КМ 8 р при плотности протопластов 10-1 О /мл и переносят в чашку Петри. Чашки закрывают и переносят в термостат, Инкубирование протопластов происходит в темноте при 28 С. Первое деление протопластов наблюдают на1549995 тов наблюдают на вторые сутки культивирования, Эффективность высева протопластов достигает 10-80 от числавыделенных, На 5-е сутки культивирования протопласты разводят питательнойсредой МС, содержащей фитогормоны,мг/л: БАП 1; -НУК 0,1, В этих условиях колонии каллуса растут и зеленеют на свету,П р и м е р ы 2 и 3. Способ осуществляют аналогично примеру 1, толькоиспользуют другие сорта сои и несколько отличающиеся концентрациифитогормонов.Способ позволяет получить иэ 1 гьткани до 1,2. 0 протопластов, которые культивируют в жидкой питательнойсреде. Протопласты обладают высокойчастотой деления (до 80).Способ позволяет избегать сложных Формула изобретения Способ выделения и культивирования протопластов из растительных тканей сои, включающий стерилизацию растительного материала, обработку целлюлолитическими и пектолитическими ферментами и последующее культивирование очищенных протопластов, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода протопластов и упрощения процесса культивирования, в качестве источника прртопластов используют незрелые зародыши сои, а культивирование протопластов осуществляют в жидкой питательной среде. Составитель В, Демкин Техред М,Дидык Корректор М. Кучерявая Редактор Л. Веселовская Тираж 483 Подписное Заказ 248 ВНИИПИ Государственного комитета по иэобретеьиям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушс",ая наб., д. 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул, Гагарина, 101 втОрые сутки после выделения. Эффек-тивность высева протопластов составляет 60-70После 5 сут культивирования протопласты разводят жидкой пи 5тательной средой Мурасиге-Скуга с/0,35 М маннитолом.в качестве осмотикаи следующими фитогормонами, взятымив количестве, мг/л: 2,4 Д 0,1-0,4;6-БАП 0,2-1,0; с-НУК - 0,1-1,0; пиклорам 0,02-0,08. Через две недели образовавшиеся микроколонии разводятаНалогичной средой с О, 25 М маннитолом, После 5 недель культивированияобразуются колонии,. интенсивно зеленеощие при переносе их на плотнуюпитательную среду Мурасиге-Скуга,содержащую 6-БАП в концентрации 0,51,0 мг/л и Ы-НУК в концентрации 0,01 -0,1 мг/л, в условиях освещения при 20интенсивности света 4000 лк.Способ иллюстрируется следующимобразом,Незрелые бобы сои (сорт Брестский 2) собирают через три недели после цветения, Извлеченные семена поверхностно стерилизуют в 1 -ном растворе диоцида в течение 10 мин, затемоТмывают стерильной дистиллированнойводой. После этого снимают семенную 30кожуру, извлекают незрелые зародыши,нарезают их и суспендируют в ферментативном растворе указанного вышесостава.После 16-часовой инкубации в ферМентативном растворе протопластыфильтруют через капроновые фильтры сдиаметром пор 100 нм и осаждают центрифугированием при 500 в течение1 мин, Осадок суспендьруют в средеЯ 5 и наслаивают на 0,5 М сахарозу.После центрифугирования при 500 я собирают флотирующие протопласты, суспендируют в среде Ю 5 и осаждают.Осадок суспендируют в жидкой питатель-дной среде КМ 8 р с плотностью10пр./мл. Первое деление протоплассхем культивирования протопластов и способствует повышению выхода и эффективности высева., Способ позволяет обойтись без обязательного кондиционирования питательной среды а также ряда сложных процедур, что способствует удешевлению процесса культивирования.