Способ определения мембранных нарушений эритроцитов при атеросклерозе

(71) Институт фотобиоли Белорусский институт раствором. После этог промытыми эритроцитам ливают порцию физиоло ии АН БССР совершенств вора с дигитонино о центрации 0,5 мкмол гемолизат тОдо 5 отсасыва вания врачеи(72) И;М. ОкунС.Л. Аксенцев,Р.Д. Адзерихо,С.В. Конев, И,Б. Ливна, М.Н. Романчак в отдельну робирок фот спектроАото ое 410фотом н рирования ст и к 3 рции зависимость ко го из эритроцитов г нцентрации дигитони критерий, характерление эритроцитов и емоглобина отна в этой порцииизующий распрео устойчивости к дигитонину, принимают отношение оптической плотности при концентрациидигитонина 3 мкмоль к оптической плотности в максимуме распределения, Призначении критерия, превьппающем величину 0,43, определяют мембранные нарушения эритроцитов при атеросклерозе, Изобретение позволяет добитьсяболее высокой специфичности и точности (в 4,4 раза) определения мембранных нарушений при атеросклерозе. 1 ил.2 табл. Изобретениев частности к к тносится к дицинеможетения мо д нцентрациями дигитон рдиологии,о для опредений эритро и ения опт ескои плотности волны 410 нм,ения эритроцитоыть испольэоваембранных наруш фильт редел по ус ата при длинения распредел ойчивости к д иагностическо оотношению ве атеро ерозе. изобрет особа 3 елькой ф истый ф гитонину о показа ния - повьппение точсчет проведения посльтрации крови через льтр с нарастающими ь чет еля,равческой ности с ледоват мелкопо ого личин о отн нце ти йильтрат олучен ых приолЬ и ции дигитонина 3 мк ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ П 1 НТ СССР шиц, Т.А, Алюшии А,Г, Мрочек(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕМБРАННЫХНАРУШЕНИИ ЭРИТРОТИТОВ ПРИ АТЕРОСКЛЕРОЗЕ(57) Изобретение относится к кардиологии. Целью изобретения является повышение точности способа. Для этоговенозную кровь с антикоагулянтом разводят физиологическим раствором, полученную суспензию наносят на стекловолокнистый фильтр, расположенный вотермостатируемой при 37 С ячейке,отсасывают водоструйным насосом и однократно промывают физиологическим о на фильтр с и поочередно нагического растзрастающей конкмоль с шагом каждую порцию ю пробирку. Соометрируют при осетре. По данным ят для каждой личества вьппед 1481687при концентрации дигитонина, вызывающей максимальный гемолиз,На чертеже показана зависимостьоптической плотности фильтрата отконцентрации дигитонина.5Способ осуществляют следующим образом.Венозную кровь с антикоагулянтомразводят физиологическим растворомдо клеточной концентрации 0,871 мл полученной суспензии наносят настекловолокнистый фильтр, расположенный в термостатируемой при 37 С ячейке, отсасывают водоструйным насосоми один раз промывают 4-10 мл Физраст"вора и отсасыванием экстраклеточнойжидкости, После этого на Фильтр спромытыми эритроцитами поочередноналивают по 4 мл физраствора с дигитонином возрастающей концентрации от0 до 5 мкмоль (с шагом 0,5 мкмоль/л),инкубируют 30-120 с, отсасывая каждуюпорцию гемолизата в отдельную пробирку. Содержимое пробирок фотометрируют 25при 410 нй на спектрофотометре, Поданным фотометрирования строят длякаждой порции зависимость количествавышедшего из эритроцитов гемоглобинаот концентрации дигитонина в этойпорции. Эта зависимость отражает кривую распределения эритроцитов по устойчивости к дигитонину (ЛУ). За критерий, характеризующий это распределение, принимают отношение оптическойплотности при концентрации дигитонина 3 мкмоль/л к оптической плотностив максимуме распределения (ДУ=Л 3/Л мак)При значении критерия, превьшающемвеличину 0,43, определяют. мембранныенарушения эритроцитов при атеросклерозе. П р и м е р 1. Больная К., 55 лет,поступила в кардиологическое отделение с диагнозом: ишемическая болезньсердца (ИБС) в стадии обострения,атеросклероз коронарных артерий, церебральный атеросклероз,Определяют критерий распределенияэритроцитов по устойчивости к дигитонину.Для этого 0,1 мл крови разводятфизиологическим раствором до 5,25 мли 1 мл полученной суспензии с концентрацией эритроцитов 0,8 Х наносят на 55стекловолокнистый Фильтр СР/Р (Жашап, Англия), пропускающий частицыдиаметром меньше 0,4 мкм,Подают на фильтр с помощью водоструйного насоса отрицательное давление и отсасывает экстраклеточную жидкость, На осажденные эритроциты наливают 4 мл предварительно прогретогоопри 37 С физраствора с нулевой концентрацией дигитонина, включают разрежение и фильтрат отбирают в пробирку, Эту процедуру повторяют срастворами дигитонина возрастающейконцентрации, отбирая каждый фильтратв отдельную пробирку. Затем содержимое пробирок фотометрируют на спектрофотометре при длине волны 410 нм.Результаты Фотометрирования наносятна график, Затем находят показательраспределения эритроцитов по ДУ.ЛУ = Лъ Лмакс Оф 28 Оэ 35 = 0,8 (норма0,237), доверительная граница 0,43при уровне значимости 0,05,Полученный показатель далеко выходит за доверительную границу и в3,38 раза отличается от нормы. Следовательно, им с большой степенью вероятности выявляют мембранные нарушения эритроцитов у данной больнойатеросклерозом.П р и м е р 2, Больной Д.,63 года, поступил в кардиологическое отделение с диагнозом: ИБС, атеросклероз коронарных сосудов и аорты.Расчет показателя ДУ дает следующую величину: ЛУ = Л /Д ; - 0,22//0,42=0,52 (норма 0,237, доверительная граница 0,43).Полученный показатель в 2,19 разапревышает норму и выходит за доверительную границу и, следовательно, сбольшей достоверностью позволяетопределить мембранные нарушения эритроцитов данного больного атеросклерозом.П р и м е р 3. Больной М., 64 года, поступил в клинику с выраженнымиболями за грудиной. Поставлен предварительный диагноз: ИБС, стенокардиянапряжения, ФКШ, атеросклероз коронарных артерий.Расчет показателя дигитонинустойчивостидает следующую величину ДУ == Лъ/Лмакс = Оь 344/0,80 = 0,43 (норма0,237, доверительная граница 0,43),Полученный показатель в 1,79 разпревышает норму и не отличается отзначения доверительной границы. Следовательно, вероятность правильноговывода о наличии мембранных нарушенийэритроцитов составляет 957.5Дополнительные инструментальные методы обследования позволили установить у больного диагноз атеросклероза коронарных артерий.П р и м е р 4. Больной В., 34 года, поступил в кардиологическое отделение с диагнозом: нейроциркуляторная дистония.Расчет показателя ЛУ дает следующую величину; ДУ = Л/Лмакс= 0,30/10 /0,85 = 0,255 (норма 0,237, доверительная граница 0,43).Полученный показатель в 1,07 раза превышает норму, но не выходит за15 пределы доверительной границы, что свидетельствует об отсутствии каких- либо мембранных нарушений эритроцитов у данного больного,В табл. 1 приведены статистические данные критерия устойчивости эритроцитов к ДУ для двух групп лиц. В одну группу входят практически здоровые люди, в другую - пациенты с клиническим диагнозом: ИБС, атеросклероз аорты и коронарных сосудов.25 1481687 Из табл. 1 следует, что доверительные интервалы для обеих исследованных групп с вероятностью 997 не перекрываются между собой, т.е. пред ложенный способ позволяет надежно определять мембранные нарушения эритроцитов больных атеросклерозом.Поскольку вывод о таких нарушениях делают на основании сравнения крите 35 рия ДУ, полученного для инцивидуального пациента со средним значейием критерия ДУ, характерным для нормы, то доверительная граница для нормы определяется с учетом односторонней оценки по формуле Формула изобретенияСпособ определения мембранных нарушений эритроцитов при атеросклерозе пу-тем определения структурного состояниямембран эритроцитов, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что, с целью повыше-,ния точности способа, проводят последовательную фильтрацию крови черезмелкопористый фильтр с нарастающимидо 5 мкмоль концентрациями дигитонина, измеряют оптическую плотностьфильтрата при длине волны 4 10 нм,45 определяют распределение эритроцитовпо устойчивости к дигитонину, затемрассчитывают соотношение величиноптической плотности фильтрата, полученных при концентрации дигитонина50 3 мкмоль и при концентрации дигитонина, вызывающей максимальный гемолиз, и при значении его 0,43 и болееопределяют мембранные нарушенияэритроцитов при атеросклерозе,Дуио - он ф рм где ДУ щр м доверительная границазначений критерия ДУ, соответствующих норме;нормированное отклонениепри односторонней оценке ("он = 1 при удвоенномзначении уровня значимости);среднеквадратическое отклонение; х - среднее значение критерияДУ.для выборки практически здоровых людейПодставив значения х,он (при уровне значимости 0,05) и (з , взятые из табл. 1 для группы практически здоровых лиц, получают ДУс 0,237+ + 1,64 ф 0,115 = 0,43,Таким образом, получив значение критерия ДУ устойчивости эритроцитов к дигитонину, превышающее величину 0,43 с вероятностью 957., определяют мембранные нарушения эритроцитов при атеросклерозе.В табл. 2 представлены данные о специфичности предложенного способа в сравнении с известным при выявлении изменений мембран эритроцитов при различных заболеваниях, сопровождающихся нарушением липидного обмена.Предложенный способ имеет высокую специфичность по отношению к изменениям мембран эритроцитов, вызванным именно атеросклерозом, практически не выявляет изменений при других нарушениях липидного обмена и обладает в 4,4 раза более высокой точностью по выявлению лиц с изменением мембран эритроцитов при атеросклерозе, чем известный.1481687 Таблица 1 Исследованная группа Статистические показатели Практически здоровые люди (норма) 30 0,237 0,021 0,115 0,184-0,290Больные атеросклерозом 30 0,433 0,029 0,160 0,359-0,507 п - количество обследованных лиц; х - среднее значение критерия ДУ; Б- - ошибка средней; б = Я- -й - среднеквадратичное отклонение; М - среднее значение генеральной совокупности; й - нормированное отклонение.При уровне значимости 0,01= 2,54. Таблица 2 Известный способ Предложенный способ Испытуемая группа Специфичность Специфичность Количество лиц,Доля Количество лиц,давших Доля лиц,с полодавших лиц,с полополо- тельотрицательтель-ной положи отрицательную реакцию житель- ной тельную .реакцию нуюреак- . реакцией, Е нуюреакреакцией,% цию Практически здоровые (п=48 человек) 1ИБС с нормальнымуровнем липидовв крови (п=34 человека) 17ИБС с повышенным 47 2,1 46 4,2 17 50 23,8 4 30 11,8 2,8 33 52,8 25,1 8 37 62 11,4 2,7 6,1 1,4 7,7 1,8 32 1,4 2 31 2 63 3,1 1,5 5 60 П р и м е ч а н и е. Специфичность определяется как отношение доли лиц с положительной реакцией в опытной (патология) к доле лиц с положительной реакцией в контрольной (здоровые) группах. уровнем липидов в крови (п=70 человек)Гиперлипидемия без клинических признаков ИБС (п=33 человека) Сахарный диабет (п=65 человек) Доверительный интервал средней генеральной совокупности при уровне значимости.0,01 (х-Я-Слое х+ Я )Х Х1481687 Составитель В. ГудошниковТехред М.Дидык Корректор Э,Лончакова Редактор А. Козориз Заказ 2682/46 Тираж 790 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5