Способ идентификации d-рибулозо-1, 5-дифосфаткарбоксилазы

ЕНИ ОБРЕ ЕТЕЛЬСТВУ юл. У 28ологии Ка кого ши Г., Варецразделении лекул. М.: Мир 6 Сепотпе Ехргеа 2 Вее 1 ор, ч,б 9,РИБУЛОосится к биохимик способам иде в в геле после ожет быть испол етике и селекци рощени сследуемых раурца или пшениольшим объемом фильтруют и чая экстракт ов, которые трофоретическоель тук к еле. По звлекаю ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИПРИ ГКНТ СССР ИСАНИЕВТОРСНОМУ СВИ(71) Институт бифилиала АН СССР(56) Гааль Э Медье кеи Л, Электрофорез биологических макром 1986, разд. 11, с.2Пеап С., ЬеесЬ К. з 1 оп Пцг 1 пя Иогша 1 вепг - Р 1 апг. РЬуз 3.о В 2, с,904-910. 54) СПОСОБ ИЦЕНТИФИКАЦ0-1,5-ДИФОСФАТКАРБОК Изобретение отнрастений, а именнотификации ферментоэлектрофореза, и мзовано также в генрастений.Цель изобретения - упускорение процесса.Способ осуществляют следуюобразом.Навеску листьев истений (например, огцы) растирают с неббуферного раствора,центрифугируют, полулегкорастворимых белзатем подвергают элему фракционированию в гфракционирования гель и(57) Изобретение относится к биохимии растений, а именно к способамидентификации ферментов в геле послеэлектрофореза, и может быть использовано также в генетике и селекциирастений. Цель изобретения - упрощение и ускорение процесса. Для осуществления способа экстракт легкорастворимых растительных белков с сохранением естественного соотношенияконцентраций белковых компонентовподвергают электрофорезу в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием геля водным нейтральным раствором феназинметасульфата с концентрацией 0,15-0,35 мас,7. до появленияв геле зон розового цвета в местах,локализациИ идентифицируемого фермента трубки и заливают окрашивающим водным нейтральным раствором феназинметасульфата с концентрацией 0,15 0,35 мас,7.П р и м е р 1. Навеску листьевогурца измельчают в равном (1 г1 мл) объеме трис-глицинового буфера (рН 8,3), фильтруют и центрифугируют. В дальнейшей работе используют надосадочную жидкость. Фракционирование полученной белковой смеси проводят в трубках с полиакриламидным гелем (100 х 8 мм). Состав геля,7: акриламид 7,5; метиленбисакриламид 0,2. Г полимеризуют при комнатной темпера ре, добавив 5,75 мкл ТЕМЕД, и 5 мл 0,147-ного раствора персульфата аммония на каждые 10 мл гелевого раствора, Белковый экстракт нано1497217 Формула изобретения Способ идентификации 0-рибулозо,5-дифосфаткарбоксилазы, включающий получение экстракта легкорастворимых растительных белков с сохра 30 Составитель А.Семенов Редактор Н.Киштулинец Техред М.Ходанич Корректор М,МаксимишинецЗаказ 440 б/29 Тираж 501 ПодписннеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина, 101 сят на гель в количестве 100 мкл и сверху наслаивают трис - глициновый буфер (рН 8,3), Предэлектрофорез проводят при силе тока мА на каждую 5, трубку в течение 30 мпн,затем силу тока увеличивают в 2 раза. Продолжительность фракционирования 2,5 ч,После электрофореза гели извлекают из трубок, однократно споласкива ют дистиллированной водой и окрашивают в водном растворе Феназинметасульфата (ФМС) с концентрацией 0,25% для идентификации РДФК/О. После30 мин инкубации геля в окрашиваю щем растворе на бледно-желтом Фоне геля четко проявляется ярко-розовая подоса, в месте локализации РДФК/О,П р и и е р 2. Способ осущест вляют согласно примеру 1,за исключением того, что для окрашивания ис" пользуют водные нейтральные растворы феназинметасульфата с концентрациями 0,10; 0,15; 0,25; 0,35 и 25 0,40 мас.%. Визуальный анализ результатов окрашивания показывает следующее. Оптимальной для окрашивания гелей является концентрация водного раствора ФМС 0,15-0,35 мас.%, при которой высокая интенсивность (яркость) розовых полос в местах локализации РДФК/О сочетается с высокои скоростью их проявления и слабой Фоновой окраской геля.35Уменьшение концентрации ФМС до 0,10 мас.% сопровождается увеличением продолжительности окрашивания и снижением интенсивности полос РДФК/О, что существенно затрудняет визуальное обнаружение (идентификдцию) Фермента,Увеличение концентрации ФМС выше 0,35 мас.% несмотря на высокую скорость процесса окрашивания приводит к сильному потемнению остальной части геля, что также препятствует идентификации РДФК/О (снижается избирательность реакции) . нением естественного соотношенияконцентраций белковых компонентов,электрофоретическое разделение ихсмеси в геле с последующим окрашиванием геля в водном растворе красителя до появления цветных зон в местахлокализации идентифицируемого фермента, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью упрощения и ускоренияпроцесса, в качестве красителя используют водный нейтральный растворфеназинметосульфата с концентрацией0,15-0,35 мас,%,а процесс окрашивания проводят до появления в гелезон розового цвета в местах локализации П-рибулозо,5"дифосфаткарбоксилазы.