Способ определения антител к бактериальным гемолизинам

%й О 7 Дф) о р гг.а СПИ Е ИЗО ЕНИЯ ИДЕТЕЛЬСТВ У Н ДВТ 0 РСНО Ч ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ(7 1) Курский государственный медицинский институт(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К БАКТЕ РИАЛЬНЫМ ГЕМОЛИЗИНАМ(57) Изобретение относится к иммунологии. Цель изобретения - более раннее определение антител. К взвесиклеток добавляют полужидкий агар ивзвесь эритроцитов, чувствительныхк лизирующему действию бактериальногогемолизина. После застывания агара иинкубации в термостате на поверхностьагара наливают раствор бактериальногогемолизина. Чашки инкубируют до четкого выявления зон задержки гемолиза.С помощью стереоскопического микроскопа подсчитывают количество непрозрачных зон задержки гемолиза с расположенной в центре лимфоиднойклеткой,1399685 ВНИИПИ Заказ 2662/46 Тираж 847 Подписное Произв.-полцгр. пр-тие г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Изобретение относится к медицине,а именно к иммунологическим исследованиям, и может быть использовано дляоценки имунного ответа на бактериальные гемолиэины на ранних этапах иммуногенеза.Целью изобретения является болеераннее опрецеление антител путем определения количества клеток, продуци Орующих антитала против бактериальныхгемолизинов.Способ осуществляют следУющим образом.Приготовляется в определенной концентрации взвесь клеток, к которойдобавляется растопленный полужидкийагар и взвесь эритроцитов, чувствительных к лизирующему действию взятого в опыт бактериального гомолизина. 20Например, для стафилококкового аль. Фа-гемолизина - кроличьи эритроциты,Полученная смесь наливается в чашкиПетри. После застывания агара и инкубации в термостате на поверхностьагара наливается раствор бактериального гемолизина в концентрации, необходимой для того, чтобы вызвать гемолиз эритроцитов в агаре. Чашки инкубируются в термостате до полного 30гемолиза и затем при комнатной температуре до четкого выявления зонзадержки гемолиза. С помощью стереоскопического микроскопа при боковом35освещении на прозрачном Фоне подсчитывается количество непрозрачных зонзадержки гемолиза с расположенной вцентре лимфоидной клеткой,П р и м е р. Агар Дифко в концентрации 1,4 готовили на Фосфатном буфере рН 7,2, стерилизовали и разливали в стериЛьные колбы. До опыта хранили в холодильнике. Перед опытомрастапливали на водяной бане. Для приготовления взвеси эритроцитов у кролибка из краевой вены уха брали кровьв стерильный Флакон со стекляннымибусами и дефибринировали путем встряхивания, трижды отмывали 0,9 -ным раствором хлорида натрия и готовили50-ную взвесь на среде 199.Мьппей умерщвляли под эфирным наркозом, извлекали селезенку, часть ееизмельчали.с помощью гомогенизаторав среде 199. Взвесь процеживали черезчетыре слоя капрона в силиконированную пробирку, Клетки дважды отмывали средой 199 по 1 мл, центрифугировалипри 1000 об/мин в течение 5 мин. Подсчитывали лейкоцить в камере Горяева.бГотовили рабочее разведение 210 вмлВ пробирку с рабочим разведениемлейкоцитов добавляли 0,5 мл 50%-нойвзвеси эритроцитов кролика и 1,5 млагара при 42 С. Полученную взвесь вьюливапи в подогретые до 37 С чашкиПетри. Чашки помещали в термостат иинкубировали при 37 С в течение 1,5 ч,На поверхность агара наливали 3 млраствора стафилококкового альфа-гемолизина в концентрации 0,5 ЬЬ/мл.Стафилококковый токсин был получениз ИЭМ АМН СССР кч. Н.Ф. Гамалея.После добавления токсина чашки инкубировали в термостате при 37 С в течение часа и оставляли при комнатнойтемпературе до следующего дня. С помощью стереоскопического микроскопапри боковом освещении с окулярамих 12,5 и объективом х 2 подсчитываличисло непрозрачных эон задержки гемолиза с расположенной в центре лимФоидной клеткой,Таким образом, предложенный способможет быть использован для оценкииммунного ответа на бактериальные гемолизины. Применение методики повысит информативность исследований, таккак позволит определить количествоклеток, продуцирующих антигемолизины,т. е. оценить иммунный ответ более всесторонне и на более ранней фазе иммуногенеза. За счет того, что оценивается не только конечная, но и болееранняя Фаза иммуногенеза, повьппаетсяточность оценки, так как появляетсявозможность оценки динамики процесса,Формула изобретения Способо определения антител к бактериальным гемолизинам путем проведения реакции нейтрализации гемолизинов антителами, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью более раннего определения, реакцию нейтрализации проводят путем смешивания лимфоидных клеток, продуцирующих антитела с эритроцитами в агаровом геле, инкубации, внесения на поверхность агара бактериального гемолизина с последующим учетом количества клеток, образующих зоны локальной задержки гемолиза.