Способ определения пиридоксаля или пиридоксаль-5-фосфата

ОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ ЯЦ РЕСПУБЛИК 111 6 01 Н 21/ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТк двтоскому свйдЕткпьСтау(71) Институт молекулярной биологииАН СССР и Центральный научно-исследо"вательский институт туберкулеза(56) 1. Вагап Х.А, И 1111 аав Н.Ь.1 пЬ 1 Ь 1 Моп 1 п Юе пегчоцв Зув 1 еюп апйдаава-ав 1 поЬШуг 3.с АсЫ. Нею Тот)с.1970, р. 275.2. Нав)се 11 В.Е. Зпе 11 Е.Е, .Ап1 шргочео 1 АроВгурФорЬапаве Аввау акогРух 1 йоха 1 РЬоврЬайе, Апа 1. В 1 осЬмп,45, 1972, р5 б 73. СЬапЬап М.З., 0 а)свЬ 1 павигС 1 К.,Р 1 иогове 1 г 1 с Аввау ой Руг 1 йоха 1 апйРуюЫоха 1-5-РЬоврпаВе. Апа 1, В 1 оспеш.96, 1979, р. 426 (прототип).(54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПИРИДОК-САЛК ИЛИ ПИРИДОКСАЛЬФОСФАТА путемобработки анализируемой пробы хими"ческим реагентом с последуюв(им измерением интенсивности Флуоресценцннполученного соединения, о т л и ч ав щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа, в качестве химического реагента используют о-метилгидроксиламин, обработку проводят при рН4-5, а измерение интенсивности Флуоресценции проводят при рН 6-7.Заказ 9095/50 Тираж 873 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Х 1-35, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП Патент,г.ужгород, ул.Проектная, 4 Изобретение относится к аналитической биохимии и может быть исполь"эовано в энзимологни и медицине,Пиридоксаль"фосфат (ПЛФ), ко"фермент многих ферментов азотистогообмена, является фосфорилированнымпроизводным соединения группы витамина В 6,Известен высокочувствительныймикробиологический метод, которыйоснован на использовании штампов мик" 10роорганизмов, нуждающихся для ростав соединениях группы витамина ВБ 1).Однако этот метод не обладает достаточной селективностью,Известно знзиматическое определение ПЛФ с использованием различныхапо-ферментов 2).Однако такой метод позволяет определять только ПЛФ и не пригодендля определения пиридоксаля (ПЛ), 20Наиболее близким к предлагаемомуспособу по технической сущности идостигаемому результату являетсяфлуоренсцентный метод анализа ПЛ иПЛФ, основанный на получении их ант" 5ранилатных производных, Для этогоанализируемую пробу обрабатываютметилантранилатом в абсолютном метаноле, затем восстановителем, подкисляют НС 1 в метаноле, упаривают в З 0вакууме растворяют в воде, подкисля"ют, нейтрализуют, экстрагируют мети".ленхлоридом, выделяют чистые .антра" .нилатные производные методом тонкослойной хроматографии и проводятих анализ флуоресцентным методом (3).Известный способ .позволяет опре-делить ПЛ и ПЛФ в растворах в коли"чествах до 1 нг/мл (концентрацияф 410 9 М)Недостатком этого способа является его многостадийность и сложность.Целью изобретения является упрощение способа.Поставленная цель достигается тем,что согласно способу, заключающемуся 45в обработке анализируемой пробы 0-метилгидроксиламином при рН 4-5 с последующим измерением интенсивностифлуоресценции полученного соединения,при рН 6.7 в качестве химического реагента используют О-мвтолгидроксил"амин обработку проводят при рН 4-5,а измерение интенсивности Флуоресценции - при рН 6-7Для осуществления флуоресцентногоанализа предварительно строят калибровочный график. Для этого в кювету,содержащую 2,9 мл раствора ПЛ илиПЛФ в 0,1 М Иа-ацетатном буфере рН5,0 при заданной концентрации (концентрации варьируют в пределах10-10)М), добавляют 0,1 мл 0,3 Мраствора хлоргидрата О-метилгидроксиламина в том же буфере. Реакциюпроводят в темноте при 25 С. Спустя30-40 мин доводят рН раствора до6-7 и измеряют интенсивность флуоресценции при 450 нм и длине волны возбуждающего света, равной 370 нм.Полученные данные используют дляпостроения калибровочного графика,И р и м е р. Анализируемую пробурастворяю в 2,9 мл 0,1 М Иа-ацетатного буфера рН 5,0, добавляют 0,1 мл0,3 М раствора хлорида О-метилгидроксиламина в 0,1 М Ба-ацетатном буфере рН 5,0. Реакцию проводят в тем-ноте при 250 С. Спустя 30-40 мин доводят рН раствора до 6-7 и измеряютинтенсивность Флуоресценции при450 им и длине волны возбуждающегосвета 370 нм. Концентрацию ПЛ илиПЛФ определяют по калибровочному гра.фику, вводят коррекцию на разведениеисходного растовра.Таком образом, предлагаемый способ значительно проще и осуществляется быстрее известного способа,требует небольшое количество реактивов и позволяет проводить флуоресцентное определение образовавшихсяО-алкилоксимов ПЛ и ПЛФ непосредственно в реакционной смеси без предварительного выделения,Преимуществом предлагаемого способа является гладкое протекание реакции образования оксимов в водныхрастворах, что существенно, поскаль"ку при биохимических и медико-биологических исследованиях содержащее ПЛи ПЛФ приходится определять именно вводных средах.Чувствительность предлагаемогоспособа составляет для ПЛФ 110 М,а для ПЛ - 4 10-ОМ при соотнош ниисигнала к шуму равном 8:1,