Способ получения полипептидов, обладающих противозачаточным действием
Похожие патенты | МПК / Метки | Текст | Заявка | Код ссылки
Номер патента: 683603
Автор: Вернэн
Текст
патти нтеО;, оР ОПИСАНИГ ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советскиа Социалистических Республик(23) Приоритет - (32) 07. 05. 73 51) М. Кл. А 61 К 37/О и сударствеиини комиге СССР о лелвм изобретг иий и открнгий1) 35789 ША К 615.76 (088,8 публиковано 30,08.79.Бюллетень,% 3 ата опубликования описания 300879обретения ностранная фирмаайо Стейт Юниверсити( 54 ) С ПОС ОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ, ОБЛАДАЮИИ ПРОТИВ ОЗАЧАТ ОЧНЫМ ДЕЙС 1 ВИЕг 1 е-Сув в А 1 а)тг-АгЧ-Ча 1-. го-А 1 а в ец-Гг ьо г у-Аг сг-А в р-Ч а-Ьец-С 1 у-Ча 1-1 соедин патент ратуре и-Ча 1-Ча 1-С ув-Аяп-Т сго-С 1 узоЧа 1 -Ьец-Яег-Сув-С 1 п 1-А ег-Туг-А 1 а 9 оув-А 1 а-Ьец гтг - ТгАгу-яег- Ьув-Аярув-Аг 1 оо Авр - :уя С 1 у-Ча 1-С Изобретение относится к медицинской промышленности и касается полу-чения противозачаточных средств,ПРедложенные полипептиды - новыеения и способ их получения вной и научно-технической литене описан,Целью изобретения является получение полипептидов, обладающих противозачаточным действием.Эта цель достигается тем, что полипептидный компонент, выделенный изфолликулостимулирующего гормона, лютеостимулирующего гормона или их-П р и м е р 10. Изготовляют раствор из гемоцканина из Кеуйо 1 е 11 пре 1 (КНЬ) (7 мг/мл) н 0,05 моля натрийфосфатного буфера в 0,2 моля хлористого натрия, РН 7,5. Нерастворимые частицы удаляют центрифугиронанием. К 1 мл этого раствора добавляют 20 мкл толуолдиизоцианатного реактива, разбавленного диоксаном (1/30), причем количество, в основнсм, эквивалентно в пересчете на количество молей остатков лизила в молекулах КЬН-пептида .Через 40 мин при 0 С активированный толуолдииэоцианатом раствор КНЬ соединяют с 0,5 мг синтетического -НСС-пепткда, который до этого растворяют в 25 мкл 0,05 М натрийфосфатного буфера в 0,02 М хлористом натрии, рН 7,5, Смесь инкубируют при 37 С в течение 4 ч. Полученный продукт очищают гельной Фильтрацией.П ример 11. 1 г Р 1 со 11 70 растворяют в 1 мл обычного раствора и 1 мл 2 М этклендкамина (РН доводя до 10 хлористонодородной кислотой) . Раствор выдерхиьают при комнатной температуре н водяной бане, раэмешинают магнитной мешалкой, добанляют 4 г цианогенбромкда, растворенного в 8 мл диоксана. Кислотность смеси выдерживают при РН 10-10,5 в течение 8 мин, добавляя капли 2 н. Раствора гидрооккск натрия, Затем добавляют еще 2 мл 2 М раствора этилендкамина, РН 10, продолжая Размешивание при комнатной температуре в течение 30 мин Продукт очищают пропусканием через колонну кэ биогеля р:60. П р и м е р 12, 2 мг соединения, содержащего пккограммоное количество "-меченого адцукта, и 1,6 мг КЬН растворяют в 1 мл 1 М глкцинметилоного сложного эфира н 5 М гуанидингидрохлоркде. В раствор затем добавляют 19,1 мг этилдкметкламкнопропклкарбодикмкда . Кислотность доводят да, РН 4,75 к выдерживают прк этом значении н течение 5 ч прк комнатной температуре прк помощи 1 н. хлористого натрия, Сопряженный КЬН-пептид очищают пропусканием через колонну (2,2 х 28 см) кз биогеля р:60, уравновешеннуюю 0,2 М хлористым натрием,П р и м е р 13. При комнатной температуре н непрерывно раэмешинаемый раствор 1 моля полкпептида (1 - 20 мг/мл) в 0,1 М натрийфосфате порциями по 2 г добавляют через каждые 5 мкн 3 моля твердого бкфункционального дигидрохлоркда сложного имидоэФира, Для поддерживания РН 10,5 добавляют 0,1 н. гидроокись. натрия. Через 1 ч по завершении добавления сложного диимидоэфира получают полимериэонанный продукт согласно изобретению. 5 1 О 5 20 25 30 35 40 45 50 55 60 м е р 14, К РастноРУ(20 мг/мл) гомологового альбумина сыворотки в 0,1 М боратном буфере, рН8,5, 1000-ного молярного избытка25-ного водного раствора глутарового диальдегида добавляют при ксмнатной температуре. Избыток диальдегидаудаляют гельной Фильтрацией н воде сприменением биогеля р:2. Материал,собранный в пустом пространстве, лиофилизируют, сухой продукт повторнорастворяют в 0,1 М боратном буфере,РН 8,5 (20 мг/мл), смешивают с надлежащим количествсм полипептида(20 мг/мл) в том же буфере при ксмнатной температуре. Через 20 мин добавляют натрийборгидрид в 250 Ъ-нсммолярном избытке полипептидаХ,Реакция заканчивается через 1 ч. Сопряженный продукт очищают гельнойфильтрацией на колонне из биогеляр, дкалиэуют до удаления соли илиофклкзируют.П р и м е р 15. При температурениже 16 С н течение 2 ч размешквают1 г Р 1 со 1( 70, 500 мг ВаНСОЗ, 3 гхлористого цианура, 20 мл воды и80 мл диметилформамида. Продукт перегоняют против дистиллированной водыдо удаления хлора, затем лиофилизируют. Полипептид (2 мг), содержащийминкмальное количество ( -меченого25аналога, кнкубируют с 1 мг этого продукта н 0,25 мл 0,2 М натрийборатногобуФера, РН 9,5, в течение 1 ч при20 С, после чего продукт выделяют наколонне из биогеля (2,2 х 28 см) .Прк осуществлении вышеописаннойреакции с применением декстрана Т 70вместо фиколла 70 получают соответствующий модифицированный полкпептид,пригодный согласно настоящему изобретению,П р к м е р 16, 1 г фкколла 70,1,2 г натрийперйодата, 0,42 г хлористого калия растворяют в 1,5 мл 1 Мнатрийацетатного буфера, РН 4,5, иоинкубкруют при 37 С в течение 1 ч,2 мг (588 молей) полипептида, смешанного с минимальным количествомЛ -меченого аналога, инкубируют с1252 мг вышеполученного продукта н0,3 мл 0,2 М боратного буфера, РН 9,5,при 55 С в течение 1 ч. Реакционнуюсмесь затем резко охлаждают на ледяной бане, после чего добавляют 1 мгнатрийборгидрида. Реакцию восстананления прекращют пропусканием продукта через колонну из биогеля р(2,2 х 28 см), уравновешенной и элюированной 0,2 М хлористым натрием.П р и м е р 17. Несколько кроликов иммунизируют различными синтетическими пептидами, сопряяенными с образонанием разных модифицирующихгрупп, После двух клк трех приемониммунизации через интервалы от 3 до5 недель сыворотки от подопытных жи-Тйг-ТЬг-Аяр-Суя - 61 уу-Рго-Ьув-Аврвотных оценивают путем определения их способности связывать в пробирке радиоактивно меченный НС 6. Специфику этой связи исследуют по реакции этих же сывороток относительно дугих протеиновых гормонов, меченных обычным 5 способом, в частности ЬН-придатка мозга. Сыворотку далее оценивают путем определения ее способности ингибировать биологическое действие НС 6, экзогенно введенного в организм животных в биологическом тесте. Так, увеличение веса матки беременных крыс, как реакция на предписанную дозу НС 6, подвергается регистрации, Дозу НС 6 вводят подкожно в физиологическом растворе поваренной соли - 5 впрыскиваний в течение 3-х дней, затем животное убивают с целью удаления матки на четвертый день. Вес матки увеличивается в соответствии с ув еличением к оличества в прыск ива ний гормона. При оценке действия антисывороток независимо от подкожного введения гормона также вводят разные количества опытной сыворотки внутрибрюшинным путем, Это способствует 25 быстрсму поглощению антисыворотки кровяным потоком крысы и позволяет взаимодействовать ему с гормоном, когда последний поступает в кровь. Если антисыворотка способна взаимо действовать с гормоном, для предупреждения стимуляции матки, сыворотку считают эффективным биологическим ингибитором действия гормона.П р и м е р 18, Йодбензойную кис лоту, растворенную в слабсм избытке 1 н. гидроокиси натрия добавляют в пептид в фосфатном буфере с обычньм раствором при РН 7,0, По истечении 30 мин при комнатной температуре по липептидный димер очищают гельной фильтрацией.П р и м е р 19, В охлажденный на ледяной бане и интенсивно перемеши" ваемый бараний -глобулин (0,23 мл) (10.мг/мл) в 0,05 М фосфатном буфере при РН 7,5 добавляют 50 мкл толуолдииэоцианата в диоксане (1:10). Через 40 мин избыток толуолдиизоцианата удаляют центрифугированием (О С, 10 мин, 10 г),осадок дважды промывают. Соединенные оставшиеся продукты добавляют к 7,7 мг пептида, растворенного в 0,8 мл РВЯ, РН 7,5. Смесь Размешивают при комнатной температуре 10 мин, а затем инкубируют при 37 С в течение 4 ч, Сопряженный продукт очищают диализом.Предлагаемый способ позволяет получить полипептиды, которые могут быть использованы в качестве противозачаточных средств.фохмула изобретения1Способ получения полипептидов, обладающих противозачаточным действием, отличающийс я тем, что 65 йолипептидный ксмпонент, выделенный иэ фолликулостимулирующего гормона, лютеостимулирующего гормона или их -суб-единицы, человеческого плацентарного лактогена, человеческого пролактина, человеческого хориального гонадотропина, 20-30 или 30"39 аминопептида, с остоящег о и э С-к онцев ых остатков Р-суб-единицы человеческого хориального гонадотропина, общей формулыХ-Яег-Яег-Яег-Ьув-А 1 а-Рго-Рго-Ргогде Х обозначает:Яег-Ьуяц-Рго-Ьеи-Агд-Рхо-АгооТираж 672 Под пис ноеЦНИИПИ Государств ен ного к оми тета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, %-35, Раушская наб., д. 4/5 Заказ 7855/51 Филиал ППППатент , г. Ужгород, ул. Проектная, 4 или Авр-Аяр-Рго-Агд-Рпеп-Азр% Яег-Яег-Яег-Яег-Ьуз-А 1 а-Рго-Рко-РгоФ М-Ьеи-Рго,ойли Рго-Яег-Акд-Ьец-Ргоу-Рто-Бег-Аяр-ТЛг-Рхое-Ьец"Ргоп,или 61 у,или Рго- Яег-Агд-Ьец-Ргоу-Рго-Рко-Азр-ТЬг-Ргое-Ьец-Ргоп-Бег-Ьеи-Рго, Рго-Яег-Агд-Ьец-Рко 20 61 у-Рго-Рто-Аяр-ТЬх-Рго-Ие-Ьеи Рго 61 п-Я ек-Ье ц-Рго,подвергают взаимодействию с соеди 25 нением,содержащим диазогруппы, такимкак диаэосульфониловая кислота, декстран, динитрофенол, тринитрофенол, ангидрид Я-ацетомеркаптоянтарная кислота, политироэин прямой или разветвлен 30 ныйнатуральные белки, сахароза сополимериэованная с эпихлоргидрином,полиглюкоэа,гомологичный альбумин сыворотки, гемоцианин иэ КеуЛо 1 е 11 щреС илитироглобулин, которые вводят в поло 35 жение 2-40 полипептидной структуры,Способ осуществляют следующим образам.Модифицирующие группы, как гемоцианин из КеуПо 1 е 11 лре, содержащиесвободные аминогруппы, получают в буферном растворе, как фосфатный буфер, в растворе хлористого натрияпри рН - б, В этом растворе к модифицирующей группе добавляют толуолдииэоцианатный реактив, разбавленныйдиоксаном примерно от 1-10 до 1-40раэ. Количество толуолдииэоцианата,добавляемого в раствор, может колебаться в пределах 0,075-1,000 молярных эквивалентов в пересчете на ис 5 О пользованный модифицирующий агент.Реакцию можно вести при (-5)(+1 0)С, предпочтительно 0-4 С, в течение 1/2-2 ч, Избыток толуолдииэоцианата удаляют центрифугированием,55 осадок промывают фосфатным буфером,оставшиеся вещества соединяют,Этот активированный раствор модифицирующей группы затем соединяют сподлежащим сопряжению гормональнымили не гормональньзк полипептидом.Полипептид растворяют в том же фосфатном буфере (5-30 мг/мл), все количество модификатора и полипептидасоединяют с соблюдением молярногосоотношения, желательного в сопряженнсм продукте, Соединенные растворы подвергают взаимодействию при 30- 50 С, предпочтительно 35-40 С, в течение 3-6 чМодиФицированный полипептид и свободный не сопряженный полипептид 5 можно разделитьобычными приемами, например, гельной фильтрацией.В качестве индикатора в реакционную смесь добавляют пикограммовые количества ("5 меченого полипептида во время реакции сочетания, а количество полученных сопряжением полипептида с модифицирующими группами (молярное соотноыение) определяют объемом выделяемой радиоактивности.В способы модифицирования гормонов, не гормональных протеинов и их Фрагментов (немодифицированных поли- пептидов) включена реакция сочетания с применением водорастворимого карбодиимида. Аминогрупгы немодифици рованного полипептида вначале, предпочтительно, защищают ацетилированием, затем этот немодифицированный (ацетилированный) полипептид подвергают сопряжению с модификатором, как 25 натуральный протеиновый модификатор, наприглер, гомоцианин из Кеуйо 1 е 11 пре 1, гомологовый альбумин сыворотки и тп. или же декстраны, агенть Г 1 со 11 или политирозин, предпочти тельно, в присутствии гуанидина, как гуанидин НС 1, применяя в качестве активирующего реактива 10-зтил(3-диметиламинопропил)-карбодиимид. В слу" чае применения агента Р 1 со 11 70 его З 5 вначале обрабатывают этилендиамином с целью достижения более эффективного конечного сочетания. Обработку этилендиамином осуществляют в растворе или диоксане, при комнатной температуре и РН и 9-12, предпочтительно 10-11, в течение и 1/4-2 ч. Реакцию сочетания немодифицированного полипептида с модификатором проводят в растворе, напримерг глицинметилового 45 сложного эфира с выдерживанием РН 4-5, предпочтительно 4,5-4,8, при комнатной температуре в течение 2-8 ч, предпочтительно 5 ч. Полученный моди- . Фицированный 1 олипептид может быть очищен обычными способами хроматогра Фией на колонке.Вызывающие иммунитет вещества получают полимеризацией немодифицированного полипептида с применением бифункциональных сложных имидоэфиров. 55 Сложные имидоэфиры (диметиладипимидат,диметилсуберимидат и диэтилм;Лонимидат) могут быть использованы для получения полимера. Полимеризацию обычно осуществляют при комнатной 60 температуре в водном растворе при РН9-12, предпочтительно около 10-11, в течение 1/4-2 ч.Вызывающие иммунитет вещества также могут быть получены димеризацией 65 через сульфидную связь, образованную окислением тиоловой группы на цис-остатке, с применением йодбензольной кислоты и реакции при комнатной температуре в течение 10-40 мин.Модифицированные полипептиды так - же могут быть получены с применением глутарового диальдегида в качестве агента сопряжения. Коммерческий глутаровый диальдегид в действительности не содеркит свободного глутарового диальдегида, а состоит из очень сложной смеси полимеров, содержащих большое количество а(., (-ненасьпенных аг)рдегидов . По в заимодейств ии с натуральными протеиновьми модифицирующими агентами, такими как гомологовые аль" бумины сыворотки, эти полимеры образуют стабильную связь посредством свабоДной аминогр анны Гъстс,вляч ле)д -.гн" ные группы свобс 1 днымн, Этст ггр 1 гя .,: " точный продукт затем в замодействг .".т с и ем одиф ици РОВ д. н н ь 1 м и О; ие и т ид ст" в присутствии боргидрида мело ного металла, такого как натрийборгидрид, Этот промежуточ ный продук т обра з уется при РН 7-10, предпочтительно 8 -9, при температуре близкой к комнатной. Модифицированный полипептид также получают при комнатной температуре г 1 а истечении около 1/4-2 ч Реакции. Полученный продукт выделяют в чистом виде обычнь 1 ми приемамн (гельной ,ил "- рацией, диализом и лисилизацней) . Полимеризованные сахарные гг,.сп:.;Ф, -каторы Г 1 со 11 70 или деке гран Т 70получают с целью использования присопряжении путем обработки гало:ангиДРиДом ЦианУРов ой кисл ать г такимкак хлорангидрид циануровой кислота.,с образованием дигалогентриазиннлсвого продукта присоединения, Реакциюведут в растворителе, таком как днметилформамид, при 0-20 С . пр но; тительно 10-15 С приблизительно )/ 24 ч. Полученный промежутогный Родг,тдиализуют до полного удаления галсп,ных ионов, лиофилизируют и обрабаты-.вают немодифицированньм полигептидомпри РН 8-11, предпочтительно 9-10с,течение 5-12 ч при 1 5-3 5 С обычнопри комнатной температуре, Полу генныймодифицированный полипептид можетбыть выделен известным способсм. Вышеупомянутые полимеризова нные сахарные модификаторы также можно сбрабатывать перйодатами щелочных металловпри РН 3-6, 30"60 С в течение 1/2 -4 ч, после чего полученный промежуточный продукт подвергают реакции сочетания с немодифицированным полиг:ептидом при РН 7 - 11, предпочтительно8-10 в течение около 1/4 - 2 ч при темопературе 15-80 С, предпочтительно 2060 С . Полученное вызывающее иммунитетвещество выделяют вышеуказанными приемами,60 Модифицирующие группы поддаютсяприсоединению только к определеннымаминокислотным частям, в частности1 они образуют химическую связь толькос гистидиноными, аргининовыми, триоэиновьми и лизинонымичастями. Таким 5образом, в занисимости от требующихсявеличины и химического вида данногомодифицированного полипептида специалисту не составит трудности вычислить максимальное число модифицирующих групп, поддающихся соединению сполипептидом, Несколько модифицирующих групп могут соединиться друг сдругом и затем присоединиться к однойамин ок ислотной час ти,Полипептиды, обладающие противозачаточным действием вводят в организмживотного или пациента предпочтитель"но с физиологически совместимьм наполнителем, поддающимся инъециронанию,еИх можно вводить с обычными наполнителями или средствами, содержащими нсоответствующем случае другие стандартные вспомогательные вещества, ввиде инъецируемых растворов или взне"сей предпочтительно для ннутримышечного применения.Количество вводимого модифицированного полипептида зависит от целого ряда фактором, однако удовлетворительных результатов достигают ЗОпри введении крупным млекопитающимстандартных доэ 0,1-50 мг от одногодо 5 раз через интервалы от 1 до 5недель,П р и м е р 1. В течение по меньшей мере одного менструального циклавзрослые самки бабуины изучались нцелях получения образцов и проб мочевых эстрогенов, плазмы, прогестина и,н некоторых случаях, мочевого гормона 4 Опередней доли гипофиза ГПДР. Иммунизации подвергались только животные,давшие нормальные образцы этих гормонов,Биологическую активность гормонапередней доли гипофиза и возбуждающего деятельность фолликул яичникау женщины хориального гормона определяют с помощью теста истощенияяичника аскорбиновой кислотоЙ, а препарат фолликулостимулирующего гормона испытывают с помощью теста увеличения яичника,Гормоны видоизменяют н антигеныпутем соединения с гаптеном при различных соотношениях гаптена и гормона.При этом процессе протеиновый гормонслужит в качестве носителя, а гаптенсоединяется с ним через диазо-связи.Хотя к различным гормонам был присоединен целый ряд гаптеновых групп,для любой комбинации применяют одини тот же основной процесс. Для получения иммунизирующих антигеновнаилучшим числом гаптеновых групп нагормоновую молекулу является 15-35, 65 Основная реакция состоит н диазотировании гаптена (сульфанильной кислотой) путем добавления его в раствор 0,11 н, соляной кислоты с последующим медленным добавлением этогораствора по каплям в 1-ный растворВаМОг при постоянном размешиваниипри 4 ОС . Диазотирование считаетсязаконченным при обнаружении свобод"ной НМО в реакционной смеси. Реакция проводится при +4 С, оптимальными температурами являются приблизительно 0-6 С.Гаптено-протеиновое соединениеосуществляют путем растворения протеинового гормона н щелочном буфере,рН л 8,0. Диаэотированный гаптен медленно добавляют в раствор гормона припостоянном размешивании при 4 С. Подобавлении всего гаптена рН окончательно устанавливают 8,0, 1-2 ч,размешивают и выдерживают в течение ночипри 4 С, Смесь осторожно диализуют6-8 дней в дистиллированную воду вцелях удаления непрореагировавшегогаптена.Хотя число диазогрупп на гормональную молекулу можно регулиронать числом нзаимодействонанших молей гаптенаи гормона, одновременно с каждым диаэотиронанием проводят параллельноеконтрольное испытание с суланильнойкислотой с меченым атомом Вн целяхуточнения состава гаптен-протеиноныхпроб. В контрольном испытании применяют тот же препарат гормона, что идля иммунизации. По окончании реакциииз реакционной смеси отбирают аликноту, остаток осторожно диалиэуют. Оди"наконые объемы диализованного и недиализованного растворов измеряют путем жидкостной сцинтилляции. Послесравнения диалиэованных и недиализованных проб подсчитывают молекулыгаптена, связанного с каждой молекулой гормона; непрореагировавший гаптен удаляют диализом, В соответстниис этим подсчетом для всех гонадотропиновых препаратов определяют молекулярный вес 30,00,После диалиэа гаптеноные гормонылиофилизируют и сохраняют при 4 С,Диазо-ХГ(35 групп на молекулу) и гормон передней доли гипофиза человека(26 групп на молекулу) испытываютбиологическим путем с применениемспособа истощения яичника аскорбиновой кислотой; при этом было обнаружено, что 62 и 85 соответственноактивности невидоизмененных гормонов,из которых они были получены, осталось. Ни один из других гормонон небыл испытан на биологическую активнос ть.Способы иммунизации. Самок бабуинов подвергают первой иммунизации втечение 3-5 дней менструального цикла, второе и третье впрыскивание -через неделю, Четвертое впрыскивание осуществляют через 2-3 недели после третьего, Несколько животных получают пятое впрыскивание через 70-80 дней после первого. Все антигены вводят подкожно в суспензии манолеата манни да или арахидного масла, Для каждой инъекции дозы антигена колеблются в пределах 3-5 мг . Последствия инъекций контролируют ежедневно в течение 5 дней после каждой иммунизации на местные реакции,Контрольное действие иммунизации. В течение по меньшей мере одного менструального цикла перед иммунизацией и в течение всего периода иммунизации до появления действия обработки каждый день собирают круглосуточно пробы мочи и непрерывно - пробы сыворотки, Измеряют мочевой гормон передней доли гипофиза ГПДГ, мочевые эстрогены и прогестины плазмы, Анти тела были обнаружены в полученных после иммунизации пробах сыворотки путем взаимодействия 0,2 мл разбавленной сыворотки (1:1000) в забуференном фосфатном рассоле (РН 7,4) и 0,5% обычной бабуиновой сыворотки с 250 пг гормона с мечеными атомами Оэ" . Сыворотки подвергают взаимодействию с немодифицированныч иммуниэирующим гормоном и с немодифицированным гор- ЗО моном передней доли гипофиэа бабуина в целях обнаружения антител. В качестве антигена-индикатора применяют очищенный препарат гормона передней доли гипофиза бабуина. Комплексы из 35 антигенов-антител осаждают с помощью овечьего антибабуинового гамма-глобулина через 24 ч после инкубации при 4 С, Уровень антител выражается в виде связи гормона с мечеными атомами,4( Значительные уровни антител являются спос об ными присоединить 5, 0 мг или больше антигена с мечеными атомами ") 1 Ъ 4Иммунные сыворотки фракционируют 45 гель-фильтрацией на Яер)тайех Сдля определения соотношения антител ЗдМ и )дб в сыворотке бабуина, Поскольку фракция ЭдС содержит определенное количество антител ЭдА и ЭдП определяют только ЗдМ и общий титр. Фракцию ЗдМ из колонны подвергают взаимодействию с (ъ-гормонами и определяют способность образования связиОбъемы фракционированных сывороток 55 отрегулированы так, чтобы уровни антител можно было сравнивать с уровнями всей сыворотки.Получение антитела, На местах впрыскивания никаких заметных реак О ций после любой иммунизации заметно . не было. В 4-х случаях наблюдалось легкое эатвердевание ткани (2-3 см в диаметре), когда в качестве носителя применяли манолеат маннида, но крас- бэ нота и опухоль исчезали в течение4-5 дней. В течение 3-5 недель увсех животных были обнаружены антитела против иммунизирующего антигена.Размер, продолжительность и перекрестность реакции этих антител зафиксированы. В общей сложности при чужеродной гонадотропиновой иммунизациинаблюдались более высокие уровни,чем при гомологических,Перекресность введенных антителс ГПДГ бабуина изучалась на каждомживотном, Перекрестность иммунных сыв ороток при пиках уров ней ф иксиров алась. Хотя наблюдалась относительновысокая активность антител против человеческого ГПДГ, реакция на ГПДГ бабуина была относительно малой. Былазамечена промежуточная перекрестнаяреакция с антиовечьим ГПДГ, а такжевысокая степень перекрестной реакционной способности с антиобеэьяньимГПДГ, Диазо-человеческий фоллпкуло.стимулирующий гормон ФСГ оказался ст.або антигенным в бабуине, Продолжите,п;ность образования антител была вышепри иммунизации человеческим и овечь.им гонадотропином, чем при использовании обезьяньего,Пики уровня антител как правилонаблюдались, когда антитела перемещались принципиально к типу ДдС. Ранние антитела обладали большим количеством типа 7 дМ и, как правило,большей перекрестной реакционной спсобностью относительно овечьего ГПДГ.Изменение количества всех антителЭдМ записывалось с самого начала обнаружения антител. Значительная перекрестная реакционная способность кбабуиновому ГПДГ наблюдалась в античеловеческих гонадотропинах, когдаЧдМ был в изобилии, но быстро спадала, когда иммунные сыворотки перемещались к почти всемЧдС. Этот перепад перекрестной реакционной способности не происходил при иммунизацииобезьяньими и бабуиновыми гормонами,Иммунизации, овечьим ГПДГ вызываливременное изменение реакционной способности при перемещении от 7 дМ кЗдС. Действие на менструальный цикл. Действие иммунизации на менструаль. ный цикл определяют с помощью наблюдения за изменениями набухачий кожи половых органов и изменением уровня гормонов гипофиза и/или яичников.Определяют запаздывание овуляции относительно ожидаемого срока, полученного по контрольному циклу. Одноживотное, иммунизированное человеческим ХГ, не показало запаздывания овуляции; у другого, иммунизированного человеческим ФСГ, запаздывание равнялось только одному циклу. У двух животных, иммунизированных челове35 40 45 50 55 60 65 Образцы гормона, были зафиксированы вали, как правило, более короткий пеВ течение этого периода не было каких-либо признаков овуляции. Первыйцикл после обработки длился 246 дней,ние 35-41 дней, но не наблюдалось последующего повышения уровня прогестинов плазмы, что означало бы овуляцию. ческим ГПДГ, и у двух, иммунизированных человеческим ХГ, запаздывание овуляции равнялось двум менструальным циклам. У третьего животного, иммунизированного человеческим ГПДГ, овуляция запаздала на рассчитанные 86 дней. Овечий ГПДГ вызывал запаэ" дывание на 88 дней.Иммунизация с помощью диазообезьяньего или бабуинового ГПДГ вызывает длительное прерывание менструального цикла, Запаздывания овуля". ции у двух животных, иммунизированных обезьяньим ГПДГ, равняются 146 и 1 22 дням, а у животных, иммунизированных видоизмененным бабуиновьм ГПДГ, овуляция наблюдается на 224 и 210 дней позже.Действия на специфические свойства гормона после иммунизации человеческим ГПДГ одного животного были зарегистрированы. Интервал между менструациями считался цикломОбразцы и пробы мочевых астрогенов и прогестина плазмы показали, что вовремя цикла иммунизации длительностью85 дней никакой овуляции не произошло. Уровень мочевых эстрогенов поднимался в течение периода обработки, но эстрогены не давали типичной реакции. Прогестины плазмы не увеличивались приблизительно до 19-го дня первого цикла после обработки. Реакции эстрогенов и прогестинов не выходилиза рамки нормального в течение второго цикла после обработки. Уровни антител повышались приблизительно, с35-го дня цикла обработки до 289-годня, начиная с первого обнаружения антител. Во время исследования этогоживотного пробы ГПДГ получить былонельзя, как и не было получено никаких данных относительно уровня этогогормона в плазме или моче,после иммунизации с помощью диазобабуинового ГПДГ. В этом животномуровни антител были ниже и существориод времени, чем при иммунизациях с помощью человеческих гонадотропинов . Во время цикла обработки уровни эстрогенов в моче и .прогестинов в плазме соответствовали нормальным образцам, но были количественно ниже нормы, образцы ГПДГ в моче заметно изменялись за счет инъекций диазо-ГПДГ Во время этого цикла уровни ГПДГ иэстрогенов в моче повышались в течеВ течение следующих 42-х дней этогоцикла не наблюдалось существенногоповышения уровня какого-либо из трех 10 15 20 25 30 гормонов до 231-го дня, когда былозамеченс сильное повышение уровней эстрогена и ГПДГ в моче. Через три дня после этого повысился уровень прогестинов плазмы, что указывало на наличие Функционирующего желтого тела яичника. В торой менструальный цикл после иммунизации длился нормально, эндокриновые образцы были нормальнымиАнтитела против немодифицированного бабуинового ГПДГ достигали максимального уровня окло 70-го дня цикла после обработки; этот уровень оставался относительно постояннымдо 190-го дня, когда было замечено устойчивое отклонение. На 215-й день этого цикла антител почти нельзя было обнаружить. Через 16 дней после этого срока был обнаружен пик ГПДГ, соответствовавший нормальному повышению уровня в середине цикла. Начиная с этого момента, функция гипофизарно-яичниковой оси животного была нормальной,Гормональные образцы животных с другими гетерологовыми гонадотропиновыми иммунизациями были сходны с таковыми у животных,иммунизированных человеческим ГПДГ, а другие животные, иммунизированные обезьяньим или бабуиновьм ГПДГ, реагировали сходно с животными, иммунизированными бабуиновым ГПДГ. Полученные на бабуинах результатыпоказывают, что модификацией гормонаразмножения путем вышеизложенных процессов ему придается антигенность ичто полученные таким образом антитела нейтрализуют натуральные эндогенные гормоны, если натуральный гормонполучен от вида животного, иммунизируемого модиФицированным гормоном,П р и м е р 2, Человеческий ХГгормон присутствует только в организме беременной женщины, гормон ГПДГиммунологически и биологически идентичен с гормоном ХГ человека, хотямежду ними существуют химические различия. Поскольку они являются биологически идентичными, эффективностьэтого иммунологического процесса можно оценить путем инъецированиямодиФицированного человеческого ХГ в организм небеременной женщины, контролируя уровни ГПДГ в крови, Образующиеся антитела нейтрализуют как ГПДГ,так и модифицированный человеческийХГ,Существ ует образец уров ней ГПДГ уженшин, он в основном постоянен досередины периода между менструациями, непосредственно перед овуляцией;в мсЫент овуляции уровень ГПДГ силь -но возрастает, помогая вызвать овуляцию. При контроле уровня ГПДГ иуровня антител видно, вызвал ли процесс или не вызвал образование антител, способных нейтрализовать эндогенный гормон размножения, а именно ГПДГ.Опыт производили на 27-летней женщине, Гормон был получен, очищен, модифицирован, В организм этой женщины был затем внеден модифицирован ный человеческий гормон ХГ, Общеиз" вестно, что антитела против человеческого ХГ реагируют идентично ГПДГ. Действие иммунизации было увеличено, в основном, контролем уровней гормона ГПДГ в крови. Затем результаты обрабатынали.Получение гормона. Клинический человеческий ХГ, полученный из мочи беременной женщины, обладает иммуно" логической степенью разведения 2 б 00 иммунных единиц/мг. В этом препарате были обнаружены вещества, вызывающие заражение, Очистку производят хроматографией и элюированием. Фракцию диализуют и лиофилизируют. Наиболее сильная фракция содержит г 7 б 00 иммунных единиц/мг, однако она дает гетерогенную реакцию при гельэлектрофорезе на олеилакриламиде. Фракцию очищают дальше гель-фильтрацией.Элюиронание показало два основных протеиноных пика. Самый сильный человеческий ХГ обнаружен в первом пике и отличается иммунологической сте пенью разведения 13,б 70 иммунологических единиц/мг . Фракцию подвергают полиакриламидному гель-электрофорезу. Дальнейшая очистка с помощью гель- фильтрации показывает отсутствие ге терогенности челон еческого ХГ на этой ступени. Материалы для исследований обрабатывают согласно вышеприведенному способу.40Вызывающие заражение вещества этого очищенного человеческого ХГ испытывают с помощью 3", применявшегося для идентификации, один образец подвергают взаимодействию с иммунны ми сыворотками против некоторых протеинов, дающих сильное загрязнение, К этим протеинам относятся ФСГ, человеческий гормон роста, полная человеческая сыворотка, человеческий белок, трансферин, альфа-глобулин, альфа-глобулин и орозомукоид. Не было обнаружено ни одной связи очищенного человеческого ХГ с какой-либо иммунной сывороткой при разбавле" нии каждой 1:50, Эти отрицательные результаты показывают, что загрязнение любым из них было ниже 0,005.Видоизменение гормона. Гормон видоизменяют путем связывания с гаптеном (сульфанилазо), В соответствии 60 с этим способом молекулы гаптена связывают с протеином через аминогруппу алифатической или ароматической частей гаптена, Число молекул гаптена, соединенных с каждой молекулой челове ческого ХГ (га-ЧХГ) может регулире -ваться; в настоящем случае для получения иммуниэирующего антигена используют 40 гаптеновых групп на молекулу ЧХГ,После процесса связывания гаптенага-ЧХГ стерилизуют и испытывают,Пациентка уже родила несколькодетей; свойстна размножения были прекращены добровольным двустороннимудалением фаллопиевой трубы. Пациентка была здорова, менструация была регулярной, Она была подвергнута полному медицинскому осмотру с последующей лабораторной оценкой полученныхданных, включая гемограмму, анализмочи, латексную фиксацию и мазок Папаниколау (Р. втеак) . Аллергией никогда не страдала.В целях демонстрации нормальнойфункции гипофизарно-яичниконой осидо иммунизации, начиная с первого дняменструации, в течение 10-ти днейкаждый второй день брали кровь, затем каждый день в течение 10-ти днейи, наконец, каждый второй день доначала следующей менструации, Былиосуществлены качественные анализы сывороток ФСГ, ГПДГ, эстрона, экстрадиола и прогестерона. Эти исследования показали наличие овуляции,10 мг га-ЧХГ антигена растворяютв 1,0 мл раствора и эмульгируют темже к оличеств ом масла, Перед инфекциейберут кожные пробы с насечками относительно антигена и носителя. Иммунизацию проводят н фазе образования желтого тела яичника н целях предупреждения снерхонуляции иэ-за введенногоЧХГ, Пациентке пронодлт четыре впрыскивания через каждые две недели. Первые два вводят н масле подкожным путем (1,0 мл н верхнюю часть каждойруки); последние два впрыскиваниявводят в растворе только через кишечник. После каждого впрыскивания проверяют данление крови, а также возможную аллергическую реакцию пациентки,Через две недели после первого впрыскивания начинают каждую неделю брать кронь и целях определения наличия гуморальных и клеточных антител. После окончания процесса иммунизации отбирают кровь аналогично способу в контрольном цикле в целях подтверждения действия иммунизации на гормональное распределение менструального цикла, Поскольку антитела против ЧХГ реагируют идентично Г 11 ДГ, тс их подвергают контролю в качестве показателя эффективности процесса. Третий цикл исследуют аналогично через б месяцев после первой иммунизации. По окончании исследований лабораторные оценки были повторены.Пробы сыворотки контрольного цикла и цикла после обработки были испытаныП р и м е р 3, Дополнительно исследовали 29-летнюю женщину, Аналогично примеру 2 гормон был получен,очищен, модифицирован и введен пациентке, которая находилась под контролем и подвергалась исследованию,как описано в примере 2.Результаты не отличались от полученных в примере 2, за исключениемтого, что уровни эстрона и эстрадиола в основном были нормальными. У пациентки вырабатывались значительныетитры антител в последнем отрезкепослеиммунизационного цикла; в цикле,исследованном через б месяцев, У пациентки не было значительных повышений Уровней ГПДГ в серединецикла,П р и м е р 4. Исследовали 29-летнюю женщину. Гормон получают, очищают и модифицируют и вводят (аналогично примеру 2) пациентке, которую наблюдают и исследуют, как и в примере 2,Результаты не отличаются от полученных в примере 2, за исключениемтого, что фолликулярная нулевая лиП р и м е р 7, Дополнительно исследуют еще одну 28-летнюю женщину. Гормон получают, очищают, модифицируют и аналогично примеру 2 вводят в организм пациентки, которую контролируют и исследуют как в примере 2.Результаты не отличаются от полученных в примере 2, за исключением того, что до трех первых впрыскиваний не было обнаружено титров антител против ЧХГ, в послеиммунизационном цикле фолликулярная нулевая линия и уровни ГПДГ фазы образования желтого тела яичка; не наблюдается ни пиков, ни повышений в середине цикла ГПДГ, во время фолликулярной фазы повышены уровни эстрона; в шестимесячном цикле не обнаружено значительных титров антител,на наличие ФСГ, ГПДГ, эстрона, эстрадиола и прогестерона,Результаты. Соотношения во времени между гипофизарной сывороткой игонадальньви гормонами в контральныхциклах пациентки Фиксировались . После двух впрыскиваний в организме па"циентки были обнаружены титры антителпротив ЧХГ, Во время проведения иммунизации менструация проходила черезопределенные интервалы времени, 10После первого впрыскивания в манолеате маннида на месте впрыскиваниянаблюдались эуд и опухание. Последующие введения через кишечник в растворе не вызывали никаких реакций, изчего было заключено, что местные реакции обусловлены манолеатом маннида.Тесты лимфоцитной трансформации наобразцах плазмы давали отрицательныерезультаты,В течение цикла после обработки Юфолликулярная нулевая линия и уровниГПДГ фазы образования желтого телаяичника сильно не изменялись, По сравнению с обычным большим повышением всередине цикла наблюдались лишь очень 25незначительные повышения уровня ГПДГ.Распределение ФСГ в цикле после обработки было нормальныч. Это указываетна то, что антитела нейтрализовалидействие эндогенного ГПДГ.Пациентку исследовали в течениееще одного цикла приблизительно черезб месяцев после первой иммунизации.Были обнаружены значительные титрыантител, указывающие на незначительное повышение ГПДГ в середине цикла,тогда как ФСГ в основном были нормальны. Таким образом была доказанаспецифичность анти-ЧХГ-антител кГПДГ, но не к ФСГ,40 ния и уровни ГПДГ фазы образованияжелтого тела яичка в послеиьмунизационном цикле были в значительной степени понижены; йе наблюдается повышения уровней ГПДГ в середине цикла;эстроновые уровни повышены в течениефолликулярной фазы послеиммуниэационного цикла; в течение шести месяцевисследований не было замечено значительного повышения уровней ГПДГ в середине цикла,П р и м е р 5. Исследуют 35-летнюю женщину. Гормон получают, очищают,модифицируют и аналогично примеру 2вводят пациентке, которую контролируют и исследуют как в примере 2,Результаты не отличаются от полученных в примере 2, эа исключениемтого, что в послеиммуниэационном периоде фолликулярная нулевая линия иуровни ГПДГ в Фазе образования желтого тела яичка были заметно снижены;наблюдается очень незначительное повышение уровней ГПДГ в середине цикла;уровни ФСГ в послеиммуниэационном периоде снижены, уровни эстрона и эстра"диола уменьшены в течение фолликулярной фазы послеиммунизационного периода.П р и м е р б. Дополнительно исследуют женщину 28 лет. Гормон получают, очищают, модифицируют и аналогично примеру 2 вводят пациентке, которую контролируют и исследуют какпримере 2.Результаты не отличаются от полученных в примере 2, эа исключением того, что в послеиммуниэационном циклефолликулярная нулевая линия и уровниГПДГ в фазе образования желтого телаяичка заметно снижены; в серединецикла не замечено пиков ГПДГ; в фолликулярной фазе послеиммунизационного цикла уровни эстрона повышены; вшестимесячном послеиммунизационнномцикле не обнаружено значительногоповышения уровня ГПдГ в середине цик -ла,17 683603 18 30 15 25 20 30 40 45 50 55 60 65 Все нышеописанные примеры показывают целесообразность внедения модифицированных гормонов для нейтрализации эндогенного гормона размножения.П р и м е р 8. Модифицированный натуральнйй гормон размножения при введении его в организм животного того вида, иэ которого гормон был получен, вызывает образование антител, нейтрализующих действие немодифицированного эндогенного натурального гормона в организме животного. В примерах 1-7 применяют ФСГ, ЧХГ, ГПДГ.Очищенный препарат плацентарного лактогена получают иэ плацент бабуинов. Плаценты экстрагируют, очищают хроматографией на колонне, чистоту контролируют полиакриламидным гелем, электрофореэсм и методом испытания радиоактивными изотопами на иммунитет. Полученный материал отличается высокой степенью чистоты, а метод испытания радиоактивными иэотопами показал отсутствие загрязнения другими плацентарными гормонами.Плацентарный лактоген бабуина (ПЛБ) модифицируют путем присоединения к диазониевой соли сульфанильной кислоты аналогично примеру 1. В этом случае число диазомолекул на ПЛБ ранняется 15. Процессы иммунизации не отличаются от таковых в примере 1.В течение 4-6 недель в пробирке после первого впрыскивания диазо-ПЛБ обнаружены у б-ти самок бабуиновуровни антител против натурального немодифициронанного ПЛБ. Уровни поднялись до определенной высоты в течение 8-1 О недель и оставались в таком положении несколько месяцев, Гормональные измерения показали, что иммунизация не вызвала изменений в нормальном менструальном цикле. По" скольку ПЛБ обычно выделяется только в состоянии беременности, этот факт не был неожиданным.Все 6 самок спаринают с самцом,исследованным на плодовитость, 3 раза. (по одному разу во время трех разных циклов в течение периода плодовитости) . После каждого спаривания проводят диагноз на зачатие путем гормонального измерения. Иэ 18 ти случаев спаривания в 13-ти случаях произошло зачатие, доказанное соответствующимтестом. У оплодотворенных самок менструация появляется на 7-12 дней поз"же по сравнению с нормальньм сроком.Последующие гормональные измеренияпоказали, что у всех б-ти самок 13оплодотворений закончились выкидышами приблизительно через неделю после ожидавшегося менструального течения,Эти результаты показывают, что выработанные в организме животного после иммунизации антитела не оказывают действия на менструальный цикл у неоплодотворе нных самок, но при оплодотворении они нейтрализуют бабуиновыйплацентарный лактоген в плаценте бабуина с последующим выкидышем оченьскоро после зачатия,При модификации ФСГ, самотомедиана,гормона роста или апхоепз 1 оп 11 с применением диазосульфанильной кислоты или тринитрофенола результаты, получаемые при введении очищенного модифицированного полипептида в организм самца, указывают на стимуляцию антителнейтралиэующих нсе модифицированные полипептиды или часть их, как и соответствующий эндогенный полипептид.П р и м е р 9. Всеприведенные в вышеописанных примерах опыты и исследования проводились на бабуинах. Животные были взрослыми и способными к размножению. При исследовании подопытных организмов применяют высокоочищенные -суб-единицы ЧХГ н виде препарата биологической активности меньше 1,0 иммунных единиц/мг, Животных иммунизируют 14-26 молей/моль полипептида, связаиного с диазасульфанильной кислотой субединиц манолеата маннида.Уровни антител определяют путем связей разбавленных сывороток с 7 антигеном с меченым атомом. Пере" крестную реакционную способность иммунных сывороток измеряют посредством прямого присоединения антигенов с меченым атомом и испытанием на иммунитет с помощью способа смещения методом радиоактивных изотопов . Противозачаточное дейстние н активно иммунизированных животных определяют спариванием самок с самцами, способны. ми к размножению. Действие на орга" ниэм беременных бабуинов, пассивно иммунизированных либо овечьим, либо бабуиновым анти-ЧХГ определяют путем контроля уровней сыворотки гонадотропиноных и стероидных половых ,гормонов до и после иммунизации,8 самок бабуинов подвергают иммунизации модифицированной (-суб-едини" цей ЧХГ, У всех животных были обнаружены значительные уровни антител. Результатом иммунизации бабуинов модифицированной Р -суб-единицей ЧХГ были высокие уровни антител, реагирующих, на ЧХГ, человеческий ГПДГ и бабуиновый ХГ, но не на бабуиновый ГПДГ, Все животные остаются способными к овуляции, но после целого ряда спариваний не происходит оплодотворения, Пассивная иммунизация не иммунизированных беременных бабуиНов сывороткой овечьего анти-Р-ЧГХ вызывает нарушение беременности (аборты) и течение 36-44 ч.
СмотретьЗаявка
2022657, 07.05.1974
Иностранная фирма 3-е Охайо Стейт Юниверсити
ВЕРНЭН Ц. СТИВЕНС
МПК / Метки
МПК: A61K 38/17
Метки: действием, обладающих, полипептидов, противозачаточным
Опубликовано: 30.08.1979
Код ссылки
<a href="https://patents.su/12-683603-sposob-polucheniya-polipeptidov-obladayushhikh-protivozachatochnym-dejjstviem.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ получения полипептидов, обладающих противозачаточным действием</a>
Предыдущий патент: Устройство для непрерывного скручивания чайного листа
Следующий патент: Устройство непрерывного получения синтетических смол для производства лаков
Случайный патент: Способ крашения полиметилметакрилата