Способ получения препарата внутриклеточной глюкозоизомеразы

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИ 1 6% ОИ НИЕ ИЗОБРЕ О ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(54) (57) СНОСОВ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТАВНУТРИ 1 ЛЕ 0 ЧН 0 й ГЛ 1030 ИЗ 0 ИЕРАЗй, .предусматривающий отделение клеток,микроорганизмов, их разрушение Зав С 12 Й 9/92 С,12 й 1/04 автолизом, добавление глутаровогоальдегида, получение гранул и ихсушку, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью повышения удельнойактивности препарата и полученияпрепарата, не содержащего растворимык микробных веществ, в качествепродуЦента используют штамм Асйаоаусев а 1 Ьо 8 твсо 1 оз 28-3, при этомавтолиз клеток микроорганизмов проводят в 0,01-0, 10 Х-ном растворедетергента при 65-75 С в течение0,5-2,0 ч, нерастворимый остатокавтолизованных клеток концентрируютдо 3-ЗОХ сухих веществ, в концентратДобавляют 10-40 Х от сухих веществконцентрата пищевого белка, а полученные гранулы подсушивают до 5070 Ж сухих веществ и подвергают дублению глутаровым альдегидом,взятымв концентрации 0,2-1,0 Х.1125248 18глвкозоизомеразы и глвкозо-фруктозных сиропов - полноценных заменителей свекловичного сахара из крахмалопродуков.1 низмов - продуцентов глюкозоизомеразы .Предлагаемый способ позволяет организовать производство препарата Составитель Е. ВоробьеваРедактор Н. Джуган ТехредС,Легеза Корректор Н. Король Заказ 8435/18 Тираж 521 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Рауаскап наб.д. 4/5Подписное филиал ППП фПатент", г. Ужгород, ул. Проектная, 410 Целью изобретения является повышение удельной активности препарата внутриклеточной глюкозоиэомеразы и получение препарата, не содержащего растворимых микробных веществ. 40Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения препарата внутриклеточной глюкозоиэомеразы, предусматривающему отделение клеток микроорганизмов, их раэрушение автолиэом, добавление глутарового альдегида, получение гранул и их сушку, в качестве продуцента используют штамм АсСхпощусез а 1 Ьояг 1 зео 1 аз 28-3, при этом автолиз кле ток микроорганизмов проводят в 0,01- 0,107.-ном растворе детергента при 65-75 С в течение 0,5-.2,0 ч, нерастворимый осадок автолизированных клеток концентрируют до 3-30% сухих ве ществ, в концентрат добавляют 10-40% от сухих веществ концентрата пищевого белка, а полученные гранулы подИзобретение относится к фермент- "ной отрасли микробиологической промышленности, а именно к способу получения внутриклеточной глюкозоиэоме -разы. 5Известен способ-получения внутриклеточной глюкоаоиэомераэы иэ микроорганизмов рода Мгерйощусез путемобработки культуральной жидкостиглутаровым альдегидом, фильтрациии сушки Я ,Недостатками данного способаявляются относительно невысокаяудельная активность препарата глюкозоизомеразы, так как препарат со,держит большое количество балластных веществ микробной клетки, а также потеря части активности из-эадиффузионных затруднений, возникающих при прохождении субстрата через 20неповрежденную клеточную стенку,Наиболее близким к изобретениюпо технической сути является способполучения препарата внутриклеточнойглюкозоизомеразы, предусматривающий 25отделение клеток микроорганизмоврода Васх 11 цз, их разрушение механическим путем или автолизом на 25-1007.,смешивание с глутаровым. альдегидом,Фвзятым в количестве О, 1-1,0 мас.ч. З 0на 1 мас,ч, сухих веществ клеточноймассы; выдерживание смеси при температуре окружающей среды до образования геля, получение гранул и их сушку 12,сушивают до 50-707. сухих веществи подвергают дублению глутаровымальдегидом, взятым в концентрацииО, 2-1, 07Способ осуществляют следующимобразом,Клетки микроорганизмов, например,Асй 1 поцтусея а 1 ЬогрДзсо 1 из 28-3, отделяют от культуральной жидкости и промывают, а затем вносят в количестве1-57 по сухим веществам в нагретыйодо 65-75 С 0,01-0,10%-ный раствордетергента, имеющий рН 6-,2-6,8 исодержащий 5 ф 10 М хлористого ко 9бальта. Суспензию выдерживают 0,52,0 ч при указанной температуре,затем охлаждают до температуры окружающей среды, отфильтровывают и промывают нерастворимый остаток, представляющий собой концентрат глюкозоизомеразы. При этом происходит потеря до 607 сухих веществ клеток, аудельная глюкозоиэомеразная активность достигает 250-2707, от активности исходных клеток, причем наблюдается увеличение кажущейся актив".ности (до С 0%) за счет уменьшениядиффузионных затруднений для действия субстрата. Потери глюкозоизомераэной активности с раствором и промывны.ми водами ие превьппают 17 К концентрату глюкоэоизомеразы с содержанием3-307 сухих веществ прибавляют пищевой белок (желатин) в количестве 1040% по сухим веществам концентрата., (белок может быть прибавлен в видераствора) . Смесь тщательно перемешивают,и гранулируют а затеи полученные гранули подсушивают до 50-707, сухих веществ.К охлажденному до 4-6 С раствору глуотарового альдегида, имеющему рН 6,3-7,2 прибавляют подсушенные урану- лы и выдерживают не менее 3 ч при указанной температуре для дубления, а затем отфильтровывают и сушат полученный препарат.За единицу глюкозоизомеразной активности (ГиА) принимается количество фермента, которое катализирует превращение 1 МИ субстрата в продуктоза минуту при 70 С, рН 7,0 концентрации субстрата (о-фруктозы) 2 И, содержании ионов магния 5 ф 10 М. П р и м е р 1. (контроль), 81,8 гвлажной биомассы Асйдпошусез а 1 Ьор;гдзсо 1 ив 28-3 (ГиА 350 ед/г СВ,В 95,30, где В - массовая доля влаги%), подвергают автолиэу при 25 СЭ 1125248 4в течение 5 ч (577, ГиА в растворе), еще 1,5 л (П промывка) и, наконец,затем прибавляют 6,4 г 257,-ного раст" еще двумя порциями воды по 1 л (Юйвора глутарового альдегида и 1 У промывки), В промывным водах(0,42 мас,ч на 1 мас.ч. сухого ве- определяют оптическую плотность прищества клеточной массы). Через 1,5 ч , 280 и 260 нм, чтобы оценить содержаобразовавшийся гель экструдируют и ние в препарате легко вымываемых вевысушивают полученные гранулы на воз- ществ - компонентОв микробной клетки,духе. в частности, содержание белка иПолученные 7,7 г препарата промы- нуклеиновых кислот. Результаты опытавают 1, 5 л воды ( 1 промывка) затем 10 приведены в табл, 1,Т а б л и ц а Пример 2 Промывка Пример 1 Параметр 230 О, 140 0,155 2,050 2 бО Содержание белка,мг/л 1881 126 Содержание нуклеиновыхкислот, мг/л 70 0,040 0,040 О, 210 О, 230 Я ВО 260 Содержание белка,мг/л 28 153 Содержание нуклеиновьмкислот, мг/л 0 0,125 О, 140 28 О 0 260 Содержание белка,мг/л 0 89 Содержание нуклеиновьмкислот, мг/л 0 2 Во 0 Е,О 30 0,040 1 У 0 2 бо Содержание белка,мг/л 0 16 Содержание нуклеиновыхкислот, мг/л П р и м е ч а н и е: Е 2 В и Е 2 оптические плотности растворов при 280, и 260 нм соответственно в кювете длиной 1 см.0 8 4 50 40 53 5 90120 05 4 М - масса СВ автолизованных клеток в процентах о т".3 0%45 55 После промывки получено 4,7 г прегарата (В 13,2%), при этом потеря массы при промывке 39%. Активность полученного образца 75 ед / г сухого вещества что составляет 23% от 1 заданной активности; Максимальная потеря активности из-за перехода части фермента в рас воримое состбяние наблюдается при обработке биомассы 0,10%-ным раство ром цетилпиридинийхлорида.и составляет соответственно 3% (60 мин) и 4% (120 мин). В остальных случаях активность в растворе не превышает 1% от заданной. Обработка 0,03%-ным раствором додецилсульфата натрия в течение 120 мин приводит к "кажущемуся" увеличению активности на 10 по сравнению с заданной.Получение препарата внутриклеточ ной глюкозоизомеразы.К 246 г нерастворимого остатка, полученного после автолиза в 0,01% ном растворе цетилпиридинийхлорида в течение 1 ч (ГиА 38 ед/г СВ, В 97,0%) прибавляют 10 г 10%-ного раствора желатина (О, 12 мас.ч. на 1 мас.ч. СВ нерастворимого остатка) перемешивают до гомогенного состояния и получают гранулы экструзией, Гранулы подсушивают до 50% СВ при 25 С, а затем помещают в 100 мл Полученный препарат обладает низкой глюкозоизомеразной активностьюи имеет большое количество растворимых веществ , для удаления ко торых требуется многократная промывка (не менее 0,6 л воды наг препарата,сохлажденного до 5 С 1%-ного раствора глутарового альдегида, выдерживают 3 ч при 5 С, а затем отфильтроовывают и промывают 0,5 л воды (1 промывка) и еще тремя порциями воды по 100 мп (П,Ш и 1 У промывки). В про мывных водах определяют Е и Е260 (см.табл.1). Как видно из результатов, уже после П промывки в .растворе отсутствуют белки и нуклеиновые кислоты (объем промывных вод не более 0,06 л на 1 г препарата) .После сушки на воздухе при 25 С получено 9,2 г препарата (В 13,0%), при этом потеря массы составляет сколо 5% от исходных сухих веществ,Активность препарата 245 ед/г СВ, что составляет 70% от заданной в концентрате глюкозоизомеразы и 82% от активности исходных клеток.П р и м е р 3. Проведение автоли за клеток Асйпошусез а 1 Ьобг 1 зео 1 цз 28-3.К 1800 мл 0,10%-ного раствора додецилсульата натрия, нагретого до45 670 П р и м е р 2.Проведение автолнзаклетокАсС 1 пошусез а 1 Ъо 8 г 1 зео 1 из 28-3.К 1800 мл раствора детергента,прибавляют влажную биомассу (В 94,8 ХГйА 300 ед/г сухого вещества), переПетилпиридинийхлорида заданной в исходной биомассе (по СВ),кобальта, прибавляют 200 г влажнойбиомассы (В 97,0 Х, ГиА 300 ед/г СВ),уперемешивают и выдерживают 0,5 ч 35при 75 С, а затем отфильтровывают нерастворимый остаток и промывают егодвумя объемами воды. Активность полученного концентрата глюкозоизомеразы 400 ед/г СВ,.получено 45 г(В 90,0 Х 40потеря массы. 25 Х),Получение препарата внутриклеточной.глюкозоизомеразы.К 45 г концентрата глюкозоизомеразы прибавляют 10 мл раствора желатина 4содержащего 0,45 г СВ (0,1 мас.ч,на 1 мас.ч. СВ концентрата)тщательно перемешивают охлаждают до 5 С иФгранулируют.Гранулы подсушивают до 7 ОХ СВ и поме- Ощают в 50 мл 0,2 Х-ного раствора глутарового альдегида,.имеющего рН 6,5.После выдерживания в течение 12 чопри 5 С гранулы отфильтровывают,промывают 0,2 л воды и сушат навоздухе.Получено 5,5 г препарата (В 14, 1 Х)ГиА 287 ед/г СВ), выход от заданной мешивают и помещают в териостатпри 65 С на определенное время., Затем6ыстро охлаждают и отфильтровываютнерастворимый остаток, его промываютдвумя объемами воды., и определяютмассу,ГиАи содержание сухих веществ:Результаты опыта приведены в табл,2.блица 2 активности 75 Х, выход от активности исходных клеток 96 Х.Н р и м е.р 4. Для автолиза в О,ОЗХ-ном растворе додецилсульата натрияри 70 С берут 200 г влажоной биомассы Аспошусез . а 1 Ьо 8 чзео 1 цз 28-3 (В 70,0%, ГиА 260 ед/г СВ) на 1800 мп раствора детергента и проводят автолиз в течение 2 ч. Получено 95,8 г концентрата глюкозоизомеразы (В 70,0 Х) с ГиА 716 ед/г СВ. К полученному концентрату глюкозоизомеразы прибавляют 30 мл раствора желатина, содержащего 9,6 г СВ (0,4 мас.ч. на 1 мас.ч. СВ концентра-. та), перемешивают и гранулируют. Гранулы подсушивают до 60,ОХ СВ при 25 С, а затем,нх подвергают дубЖонию в 250 мл О 4 Х-ного раствора глута"орового альдегида при 5 С в течение.3 ч.После промывки и сушки на воздухе получено 39,5 г препарата глюкозризомеразы (В 15,0 Х), ГиА 383 ед/г СВ, что составляет 75 Х от заданной актив1125248 10 Количествжелатина Выход Нерастворимый кон центратСодер жанне СВ в кон- центрате, Х Пример Вид и кон- центрация детергента,Х ТемпеВремя,чо удель-ой акобщийпроцентот исходного в.процентах к СВконцентрата,й ра- тураС дельнаяактивностьед/г СВ масса впроцентахот массыСВ исходных клеивнос и про)цент от исходного ток 100 100 100 100 100 100 135 108 80 0,01 81 179 45 182 100 100 100 94 60 2 0,03 110 40 100 100 100 108 135 80 О;10 93 185 705 94 235 40 2,0 0 - 300 100 100 100 12 94 126 378 0,01 47 78 167 500 2,0 100 300 100 100 223 45 2,0 - 670 0 - 300 1, 5 - 670 0,03 100 100 100 100 45 223 0,10 100 ности и 1473 от активности исходнойбиомассы. Обработка детергентом клеток11 25 5 4,7 350 ДДС 65 0 - 300 1,0 - 405 1,5 - 538 2,0 - 546 0 - 300 1 5 - 470 2,0 - 825 0 - 300 0,5 - 405 1,5 - . 556 Снижение температуры приводит кбольшим Потерям активности глюкозо1 125248 2изомеразы в результате перехода части ратуры выше 75 аС приводит к частичнойфермента в раствор. Увеличение темпе- ,инактивации глюкозоиэомеразы (табл.З).Таблица 3в 3 Получение гранулированного препарата римечания СодержаниеСВ в гранулах,йУдельная ак Концентрацияглутароного алдегида,еханиеская в иост ностьед/г е то 2 онтрол 5 245 5ыход подель.ой активности впроцентах от,ГиА обработаиныхклеток Общийв процентахот активностиисходОбщий выход в проце тах от исход- ного Гранулы частично разрушаютсяпри попаданиив раствор глутарового альдегида(0,03) 70 2 27 0 5,0 40 10 - 3 113 03 202 8 7 42 80 1,0 3 О 6 2 5 7 ЛДС 6 2 7 2 16 472 4 0 2 8 8 0,0 Фивают визуально по наличию или отсутстви нии при 70 С;+ФФ механически прочный без ь оц шива аническур прочносткубации при перемеается)Г,- додецилсульфат- цетилпиридинийхл к м3 ч атри орид ае Таким образом, предлаг позвмяет получить препа клеточной глюкозоизомера ностьр в четыре раза бол т с е расп М ЦПспосо нутри- ктив- чем известному сть количество римых веществ 7-8 раз. собу, а также сокраегко вымываемых раст микробной клетки25248 15 Продолкение табл.З Получение гращщированного препарата Об имечания бщий ъ- .мход п ак елъной акь ивноси,в проценнроентах т акности исход абе 7 5 Вл пос нул ные е дубленочны 4 2 14 2 212 6 5 До 83 активности в растворе нактива нактив/образующейся в результа ФФ механически прочный ультатегранул 30 мии кипячения габая муть ,+ механи акул препарат чески непроч о азной актйв я получения о позволяет При получении препарата глюкозо,н.":омеразы предлагаемым способом может быть использована биомасса продуцентов, обладающих более низким уровнем глюкозоизомчем это необходимотинного препарата,с расин ь ассортимен кроорга Содераа;лах, Й в и тах исх ног 113 потери активности в раствор 153 инактивациипад действиемвысокой темпертуры обработкиклеток