Способ получения экзотоксина а из pseudomonas aeruginosa

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКЗОТОКСИНА А ИЗ PSEUDOMONAS AERUGINOSA, включающий полициклическое культивирование штамма РА-7 в жидкой питательной среде с добавлением стимулятора токсинообразования глюкозы на первом цикле, в условиях аэрации и перемешивания, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, на втором и последующем циклах культивирования в качестве стимулятора токсинообразования используют пируват натрия в количестве 0,05 - 0,1 г/л.

Изобретение относится к микробиологии, в частности к способу получения экзотоксина А синегнойной палочки, который может служить антигеном при создании диагностических препаратов, а также в атоксической форме может быть использован в качестве компонента ассоциированной вакцины для профилактики инфекций, обусловленных Pseudomonas aeruginosa.
Цель изобретения повышение выхода целевого продукта.
Изобретение заключается в том, что многоциклическое культивирование проводят в ферментере на синтетической питательной среде в условиях аэрации с добавлением в питательную среду 0,2% глюкозы только в первом цикле культивирования. Во всех последующих циклах культивирования в питательную среду добавляют пируват натрия в количестве 0,05-0,1 г/л.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
П р и м е р 1. Способ получения экзотоксина А синегнойной палочки осуществляют следующим образом.
Агаровую культуру второго пассажа засевают в ферментер до концентрации 1,5-2,0х10⁹ кл/мл в питательную среду следующего состава: 0,3% КН₂РО₄; 0,2% NH₄PO₄; 0,3% цитрата натрия; 0,4% цитрата аммония; 0,0001% FeSO₄x7H,O; 0,3% глутаминовой кислоты, 0,005% MgSO₄x7H₂O; 1% молочной кислоты; 0,001% лактата кальция; 7,5% диализата дрожжей, 0,2% глюкозы. Подращивание культуры проводят 3-4 ч при 32^оС и аэрации, обеспечивающей 70-90%-ную концентрацию растворенного кислорода (перемешивание 500 об/мин, воздух 14,7 л/мин), когда содержание микробных клеток составляет 10-12х10⁹ мл, начинают первый цикл процесса культивирования путем добавления питательной среды того же состава до исходной концентрации микробных клеток 1,5-2,0х10⁹. Первые три часа культивирование проводят при том же режиме, что и подращивание, после чего концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне 20-30%
Продолжительность первого цикла составляет 6-8 ч, активность экзотоксина А 100 LD₅₀.
По окончании первого цикла производят слив половины объема культуральной жидкости и доливают до исходного уровня свежую питательную среду того же состава, но содержащую в качестве источника углерода вместо глюкозы пируват натрия в концентрации 0,05-0,1 г/л. Процесс осуществляют в условиях аэрации на уровне 20-30%-ной концентрации растворенного кислорода и перемешивании. "Отъем-долив" производят через каждые 2 ч до получения необходимого количества токсиносодержащей культуральной жидкости. В этих условиях накопление экзотоксина происходит на стадии замедления скорости роста ( - 3-5 1/ч), а активность его достигает 800 LD₅₀.
В процессе культивирования определяют:
1. Концентрацию микробных клеток по отраслевому оптическому стандарту на 10 ЕД.
2. Удельную скорость роста ( ) вычисляют по формуле
(Перт С.Д. 1978 г.)
3. Активность токсина оценивают в биологической пробе на белых беспородных мышах массой 18-20 г путем внутрибрюшинного введения 1 мл ряда серийных разведений осветленной культуральной жидкости и в реакции преципитации в агаре с антитоксической моноспецифической сывороткой по Оухтерлони.
4. Среднюю летальную дозу токсина (LD₅₀) рассчитывают по методу Кербера в модификации Ашмарина И.П.
П р и м е р 2. Осуществляют способ культивирования Р.aeruginosa штамма РА-7 в соответствии с примером 1, при этом, начиная со второго и во всех последующих циклах многоциклического процесса, добавляют питательную среду, содержащую вместо глюкозы пируват натрия в количестве 0,01 г/л.
Результаты изучения свойств культуральной жидкости представлены в табл. 1.
Результаты осуществления культивирования P. aeruginosa штамма РА-7 по способу-прототипу представлены в табл.2.
П р и м е р 3. Осуществляют способ культивирования P.aeruginosa штамма РА-7 в соответствии с примером 1, начиная со второго и во всех последующих циклах многоциклического процесса, добавляют питательную среду, содержащую вместо глюкозы пируват натрия в количестве 0,05 г/л.
Результаты изучения свойств культуральной жидкости представлены в табл. 3.
П р и м е р 4. Осуществляют способ культивирования P.aeruginosa штамма РА-7 в соответствии с примером 1, начиная с второго и во всех последующих циклах многоциклического процесса, добавляют питательную среду, содержащую вместо глюкозы пируват натрия в количестве 0,075 г/л.
Результаты изучения свойств культуральной жидкости представлены в табл. 4.
П р и м е р 5. Осуществляют способ культивирования P.aeruginosa штамма РА-7 в соответствии с примером 1, но начиная со второго и во всех последующих циклах многоциклического процесса, добавляют питательную среду, содержащую вместо глюкозы пируват натрия в количестве 0,1 г/л.
Результаты изучения свойств культуральной жидкости представлены в табл. 5.
П р и м е р 6. Осуществляют способ культивирования P.aeruginosa штамма РА-7 в соответствии с примером 1, но начиная со второго и во всех последующих циклах многоциклического процесса, добавляют питательную среду, содержащую вместо глюкозы пируват натрия в количестве 0,15 г/л.
Результаты изучения свойств культуральной жидкости представлены в табл. 6.
Результаты таблиц NN 1-6 свидетельствуют о том, что добавление в питательную среду пирувата натрия в количестве 0,05-0,1 г/л увеличивает содержание экзотоксина А в культуральной жидкости и уменьшает количество микробных клеток. Уменьшение количества пирувата натрия ниже этого уровня не оказывает положительного влияния на содержание токсина в культуральной жидкости. Увеличение содержания пирувата натрия выше этого уровня приводит к ингибированию роста и размножения клеток, вымыванию их в процессе культивирования и полному исчезновению токсина из культуральной жидкости.
Оптимальной дозой содержания пирувата натрия в среде следует считать его концентрацию 0,075 г/л. Такое содержание пирувата натрия в среде обеспечивает максимальное содержание токсина в культуральной жидкости.
П р и м е р 7. Предлагаемый способ получения экзотоксина А Р.aeruginosa сравнивали со способом-прототипом путем изучения биологических свойств культуральной жидкости. Результаты представлены в табл.7.
Таким образом, предлагаемый способ получения экзотоксина А синегнойной палочки повышает выход целевого продукта по сравнению с прототипом в 33 раза по удельной активности токсина в культуральной жидкости.
Изобретение относится к микробиологии, в частности к способу получения экзотоксина а синегнойной палочки. Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта. Способ включает проведение процесса в ферментере на синтетической питательной среде методом многоциклического культивирования. При этом осуществляют перемешивание и аэрацию. Добавляют в питательную среду 0,2% глюкозы на первом цикле культивирования, на втором и последующих циклах культивирования в питательную среду вместо клюкозы вносят пируват натрия концентрации 0,05-0,1 г/л. 7 табл.