Способ получения пировиноградной кислоты

Способ получения пировиноградной кислоты, предусматривающий выращивание продуцирующих ее дрожжей Candida lipolytica на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода глицерин, минеральный источник азота, соли, микроэлементы и витамин тиамин, в условиях аэрации и перемешивания до максимального накопления целевого продукта в среде, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта за счет повышения степени утилизации субстрата, в качестве продуцирующих ее дрожжей используют штамм Candida lipolytica ВКМ У-2407Д.

Изобретение относится к микробиологии и касается получения пировиноградной кислоты, которая может быть использована в микробиологической, химической и пищевой промышленности, в медицинской промышленности.
Целью изобретения является увеличение выхода пировиноградной кислоты за счет повышения степени утилизации субстрата.
Способ заключается в том, что в качестве продуцента используют штамм дрожжей Candida lipolytica ВКМ У-2407, который выращивают на органоминеральной среде в условиях аэрации и перемешивания.
Штамм C.lipolytica ВКМ У-2407 Д депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР под номером ВКМ У-2407 Д и имеет следующие морфолого-культуральные и физиолого-биохимические признаки.
Морфолого-культуральные признаки. 3-суточная культура в жидком сусле и на агаризованном сусле представлена округлыми и овальными клетками размером 2,0-5,5х3,0-10,0 мкм. Встречаются длинные клетки размером 2,4х12,0-13,0 мкм. Клетки отдельные или в цепочках по 3-4 клетки.
При росте в жидком сусле при температуре 25^oC на третьи сутки образуются на поверхности среды тонкая пленка и небольшой плотный осадок на дне пробирки. Через месяц пленка тонкая, опадающая, осадок увеличивается, имеется кольцо.
Гигантская колония (4 недели) кремового цвета, слегка морщинистая, профиль конусовидный, край гладкий.
Колонии на сусло-агаре (10 дней) кремоватые, гладкие, матовые, профиль конусовидный, края ровные.
Штрих на сусло-агаре кремового цвета, слегка морщинистый, матовый, края ровные, пастообразной консистенции.
Культура на стекле на картофельном агаре на 13 сутки образует псевдомицелий типа Candida и Mycocandida.
Физиолого-биохимические признаки. Строгий аэроб. Сахара не сбраживает.
Ассимилирует D-глюкозу, L-сорбозу, этанол, глицерин, эритрит, D-маннит, сорбит, глюкуроновую кислоту, 2-кетоглюконат, 5-кетоглюконат, молочную кислоту, янтарную кислоту.
Расщепляет жир, разжижает желатину, обладает уреазной активностью, растет на углеводородах.
Не ассимилирует D-галактозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, целобиозу, трегалозу, мелибиозу, раффинозу, мелицитозу, инулин, крахмал, D-ксилозу, L-арабинозу, D-рибозу, L-рамнозу, адонит, дульцит, лимонную кислоту, инозит, D-глукозамин, арбутин.
Крахмал не образует.
Не растет в безвитаминной среде.
Не растет на нитратах.
Не растет при 37^oC.
Максимальная температура роста 35^oC.
Штамм Candida lipolytica ВКМ У-2407 Д культивируют в аэробных условиях на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода и энергии глицерин, источники азота, фосфора, минеральные соли и тиамин. Культивирование осуществляют в колбах или ферментерах. Глицерин вносят в среду один раз перед началом культивирования либо дискретно в процессе культивирования по мере потребления его из среды. При выращивании дрожжей на питательной среде, содержащей 90 г/л глицерина, и при температуре 28-30^oC и рН 3,5-6,0 выход пировиноградной кислоты составляет до 65,7 г/л, т.е. 79% от субстрата.
П р и м е р 1. Штамм хранят на агаризованной минеральной среде Ридер следующего состава, г/л: глицерин 20, (NH₄)₂SO₄ 3,0; MgSO₄ 7H₂O 0,7; NaCl 0,5; Ca(NO₃)₂ 0,4; K₂HPO₄ 0,1; KH₂PO₄ 1,0; агар-агар 25; дрожжевой автолизат 2 мл, микроэлементы (смесь Буркгольдера состав смеси микроэлементов по прописи Буркгольдера, м/л: KI 0,1; B³⁺ 0,01; Mn²⁺ 0,01; Zn²⁺ 0,01; Cu²⁺ 0,01; Mo²⁺ 0,01; Fe²⁺ 0,05).
Дрожжи выращивают на косяках агаризованной среды в течение двух суток при 28-30^oC. Клетки с одного косяка суспендируют в 5 мл стерильной дистиллированной воды и переносят в колбу объемом 750 мл, содержащую 50 мл среды следующего состава, г/л: глицерин 20; (NH₄)₂SO₄ 3,0; MgSO₄ 7Н₂О 0,7; NaCl 0,5; Ca(NO₃)₂ 0,4; KH₂PO₄ 1,0; K₂HPO₄ 0,1; микроэлементы (смесь Буркгольдера), тиамин 2 кг, вода бидистиллированная.
Инкубирование посевного материала проводят на качалке (220 об/мин) в течение 20-24 ч при 28-30^oC. Выросшие клетки (из расчета 100 мг/л по сухому весу) переносят в другую партию колб (опытные варианты) со средой того же состава, что и для посевного материала, но с концентрацией тиамина 1,5 мкг/л.
Культивирование ведут на качалке в условиях интенсивной аэрации, рН среды поддерживают на уровне 3,5-6,0 добавлением 5%-ного раствора NaOH. В культуральной жидкости после полного потребления глицерина обнаружено 15,8 г/л пирувата, что составляет 79% от использованного субстрата.
П р и м е р 2. Дрожжи выращивают на агаризованной среде, как в примере 1, но для приготовления посевного материала используют среду следующего состава, г/л: глицерин 30; (NH₄)₂SO₄ 6,0; MgSO₄ 7H₂O 1,4; NaCl 0,5; Ca(NO₃)₂ 0,8; KH₂PO₄ 2,0; K₂HPO₄ 0,2; микроэлементы удвоенная концентрация (по сравнению со смесью Буркгольдера), тиамин 6 мкг/л, вода бидистиллированная.
Посевной материал выращивают в течение суток в колбах на качалке (220 об/мин) при 28-30^oC, затем переносят в ферментер (рабочий объем 5 л) из расчета 0,5 г/л (по сухому весу).
Среда для ферментации имеет следующий состав, г/л: глицерин 90; (NH₄)₂SO₄ 4,5; MgSO₄ 7Н₂O 0,5; NaCl 0,5; Ca(NO₃)₂ 0,6; KH₂PO₄ 1,5; K₂HPO₄ 0,15; микроэлементы концентрация увеличена в 1,5 раза (по сравнению со смесью Буркгольдера), тиамин 2 мкг/л. Глицерин вносят дискретно по 30 г/л в начале и через 16 и 30 ч после начала культивирования.
Культивирование проводят при 28^oC, концентрации растворенного кислорода 60% от насыщения, рН 4,5 (поддерживают давлением 10%-ного раствора NaOH). В процессе ферментации накапливается 65,7 г/л пировиноградной кислоты, что составляет 73,5% от использованного субстрата. Результаты испытания способа представлены в таблице.
Изобретение относится к области микробиологического получения органических кислот, в частности пировиноградной кислоты, которая может быть использована, например, для производства аминокислот - триптофана, тирозина, аланина. Изобретение позволяет повысить выход пировиноградной кислоты до 65,7 г/л (70% от субстрата) путем использования в качестве продуцента штамма Candida lipolytica ВКM У-2407 Д. Дрожжи Candida lipolytica ВКМ У-2407 Д культивируют в колбах или ферментерах при 28-30^oC при поддержании рН среды 3,5-6,0 на питательной среде, содержащей глицерин, источники азота, фосфора, минеральные соли. 1 табл.